Onderzoeksstudies

In onze studies hebben we één EU-gewas onderzocht, Pisum sativum (erwt). Erwten zijn vatbaar voor een groot aantal virussen, waaronder het erwtenmozaïekvirus, het vroegtijdige bruiningsvirus en een reeks virussen van de aardappelvirus Y-groep (Potyviridae). Binnen deze laatste groep zijn het bonengeelmozaïekvirus, het gewone bonenmozaïekvirus, het erwtenmozaïekvirus en het erwtenzaadgedragenmozaïekvirus (PSbMV) allemaal belangrijke ziekteverwekkers. Wij hebben in het bijzonder PSbMV bestudeerd, waarvoor alle commerciële erwtencultivars gevoelig zijn. Deze gevoeligheid wordt nog verergerd door het feit dat dit virus niet alleen van plant tot plant wordt overgedragen door zijn bladluisvector, maar ook verticaal van generatie tot generatie wordt overgedragen in het zaad. Deze eigenschap heeft geleid tot een ernstige besmetting van erwtenkiemplasmacollecties en biedt een zeer doeltreffend middel om gewassen snel na het ontkiemen van het zaad vroegtijdig en wijdverbreid te besmetten. Bedenk dat een zaadoverdrachtsefficiëntie van slechts 0,1% zou resulteren in 10.000 infecties na het zaaien van 107 zaden/hectare, en het belang van zaadoverdracht wordt duidelijk. Momenteel wordt dit probleem tegengegaan door zaadmonsters na de oogst efficiënt te testen door immunodetectie van het viruseiwit, en door verontreinigde partijen zaad te weigeren. Als alternatief, en aangezien de zaadtransmissie in een reeks erwtencultivars varieert van 0 tot 100%, hebben wij onderzocht of resistentie tegen zaadtransmissie in verbeterde erwtenlijnen kan worden gekweekt. In testkruisingen en terugkruisingen tussen lijnen met geen transmissie of 60-80% transmissie gedroeg resistentie zich als een dominant kenmerk, hoewel het in de F2 en BC2 generaties niet segregeerde als een Mendeliaans kenmerk. De kwantitatieve aard van het fenotype suggereerde dat zaadoverdracht moeilijk op te nemen zou zijn als een resistentiekenmerk in een conventioneel veredelingsprogramma.

Natuurlijke resistentie tegen PSbMV is geïdentificeerd in erwtentoetredingen uit Noord-Afrika en Azië, hoewel deze recessieve genen tot nu toe nog niet in commerciële lijnen zijn geïntrogresseerd. Genetische analyse heeft aangetoond dat deze genen op twee plaatsen in het erwtengenoom geclusterd zijn met andere recessieve genen met verschillende potyvirusspecificiteiten. De genen sbm-1, sbm-3 en sbm-4, die resistentie verlenen tegen respectievelijk de PSbMV pathotypes PI, L-l en P4, bevinden zich op chromosoom 6, terwijl sbm-2, dat ook resistentie verleent tegen pathotype L-l, zich op chromosoom 2 bevindt. Hoewel deze organisatie suggereert dat er sprake is van lokale genconversie en translocatie tussen chromosomen 2 en 6, suggereren andere aanwijzingen dat de twee genclusters een verschillende oorsprong en functie kunnen hebben. Met behulp van recombinante hybride virussen, gemaakt tussen verschillende pathotypes, is de avirulentiedeterminant van het virus gedefinieerd als het virusgenomelinked protein (VPg) voor sbm-1 . Een structurele en functionele analyse van het sbm-1-gen is het onderwerp van een EC-Biotechnology-project # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) waarbij onderzoeksgroepen en het bedrijfsleven uit Denemarken, Finland, Spanje en het VK betrokken zijn.

De karakterisering van het sbm-1-gen zal bijzondere intellectuele en praktische voordelen opleveren. Aangezien ongeveer 20% van alle virusresistentiegenen en ongeveer 40% van de genen die resistentie verlenen tegen potyvirussen recessief zijn, zal het voor een hele reeks ziekten van belang zijn te begrijpen hoe sbm-1 werkt en wat de specificiteit bepaalt van de aangrenzende sbm- en andere potyvirusresistentiegenen. Het sbm-project kent echter ook technische uitdagingen, niet in het minst omdat het te maken heeft met de omvang en redundantie van het erwtengenoom. Het erwtengenoom is ongeveer 5 x 109 basenparen per haploïd genoom, ongeveer 50 maal groter dan dat van Arabidopsis thaliana. Het klonen van genen in erwten op basis van kaarten is nog niet gelukt en grote “insert libraries” zijn nog niet beschikbaar. In sbm-1 bestaat echter het potentieel om een nieuwe klasse van resistentiegenen te identificeren. Resistentiegenen die tot dusver uit andere soorten zijn gekloond, kunnen in twee klassen worden ingedeeld. De dominante resistentiegenen die werken tegen specifieke virussen, schimmels en bacteriën vallen in grote lijnen onder de “NBS-LRR”-klasse en bemiddelen een hypersensitieve weerstand tegen infectie. Het enige recessieve gen dat gekloond werd (mlo), bemiddelt een niet-ras-specifieke resistentie tegen echte meeldauw in gerst en wordt ook geassocieerd met de lokalisatie van de ziekteverwekker in dode cellen. Functioneel fungeert Mlo als een negatieve regulator van de constitutieve resistentie. Daarentegen is sbm-1 ras- (of pathotype-) specifiek en is het niet geassocieerd met celdood. Uit deze vergelijkingen lijken verschillende functionele mechanismen voor sbm-1 mogelijk. Ten eerste kunnen we sbm-1 zien als een dominante vatbaarheidsfactor, die nodig is om de virusreplicatie te ondersteunen. Dit zou passen bij de waarschijnlijke betrokkenheid van het VPg bij de virale RNA-replicatie en de waarneming dat protoplasten van resistente planten geen detecteerbare virusreplicatie vertonen. Ten tweede zou sbm-1, net als Mlo, kunnen fungeren als een negatieve regulator van resistentie, hoewel de specificiteitsverschillen met Mlo sbm-1 in een andere klasse van resistentiegenen zouden plaatsen. Ten derde zou sbm-1 een dominant maar dosisafhankelijk zwak resistentie-allel kunnen zijn. Wij geven de voorkeur aan de eerste optie als de meest directe en eenvoudige interpretatie.

Voor ons onderdeel in het EG-biotechnologieproject hebben wij ervoor gekozen genetische benaderingen te gebruiken om het product van het sbm-1-resistentiegen te identificeren. Na identificatie van geschikte erwtenlijnen (een BC4-paar lijnen met homozygote resistentie- en vatbaarheidsallelen) is een cDNA-AFLP-strategie gebruikt om tot expressie komende genen afkomstig van de geïntegradeerde regio te identificeren. Tot dusver zijn tien polymorfe cDNA’s geïdentificeerd. Deze worden in kaart gebracht met behulp van recombinante inteeltfamilies om hun genomische oorsprong te bevestigen. Onze alternatieve strategie bestaat erin te “vissen” naar het sbm-1 genproduct door gebruik te maken van het yeast two-hybrid systeem met het PSbMV VPg als lokaaseiwit. Twee sterke kandidaat-cDNA’s en acht andere cDNA’s die coderen voor interactie-eiwitten zijn geïdentificeerd uit een cDNA-bibliotheek voor erwten, gemaakt van een vatbare erwtenlijn. Deze cDNA’s worden ook gesequeneerd en in kaart gebracht.

Als onderdeel van een eerder EC-AIR project (# CT94-1171) waarbij academische en industriële partners in Denemarken, Frankrijk en het VK betrokken waren, hebben we ook de mogelijkheden onderzocht voor de ontwikkeling van PDR tegen PSbMV in transgene erwten. Aangezien in andere systemen gewoonlijk het virale replicase-gen is gebruikt om PDR te geven door het proces van post-transcriptionele gene silencing (PTGS) op gang te brengen, hebben wij het PSbMV replicase cistron (NIb) gebruikt voor transgene expressie in erwten. Van 35 erwtenlijnen, getransformeerd met Agrobacterium tumefaciens T- DNA met een 35S promotor -Nib – 35S terminator construct, en het bar gen als een selecteerbare marker voor getransformeerd weefsel in de aanwezigheid van het herbicide Bialophos, bleken drie lijnen resistent te zijn tegen PSbMV. Twee van deze lijnen droegen een directe herhaling van het 3′-uiteinde van het Nib-gen (NIbIb), aangezien er aanwijzingen waren dat complexe transgenarrangementen meer mogelijkheden boden om PTGS te initiëren. Al deze lijnen vertoonden een type PDR dat “herstel” wordt genoemd en waarbij inoculatie tot een initiële infectie leidt, maar de planten zich snel herstellen en geen symptomen of virusaccumulatie meer vertonen. De herstelde weefsels zijn dan resistent tegen verdere blootstelling met homologe of nauw verwante virusisolaten. Om de betekenis hiervan in het veld te beoordelen, waar de planten kunnen worden uitgedaagd door een populatie verwante virussen, werd het vermogen van verschillende isolaten van PSbMV om PTGS op te wekken en door geïnduceerde PTGS te worden getarget, beoordeeld. Hieruit bleek dat virussen met ca. 89% of meer identiteit in het NIb cistron de resistentie konden induceren, hoewel de specificiteitseisen om een tweede challenge-virus als doelwit te beschouwen hoger kunnen zijn. Ter referentie: de twee meest uiteenlopende sequenced PSbMV-isolaten verschillen met 89% in de Nib-regio. Dit verschil in specificiteitseisen voor triggering en targeting in PTGS zal een belangrijke overweging zijn voor de toepassing van de technologie op commerciële gewassen. De relatief brede resistentie tegen PSbMV isolaten in Nib transgene erwten contrasteert met de extreme pathotype specificiteit gezien voor de natuurlijke sbm-resistentiegenen waar slechts een of enkele veranderingen in de virus avirulentie determinant voldoende is om een PSbMV isolaat van avirulent naar virulent te veranderen.

Ondanks de korte periode van initiële infectie vertoonden de transgene erwtenplanten een goede groei en zaadzetting na challenge-inoculatie om opbrengsten te geven onder kasomstandigheden die gelijkwaardig waren aan die van niet-geïnfecteerde transgene of niet-transgene lijnen. Wij zijn van mening dat, afhankelijk van licentie-overeenkomsten voor het gebruik van het bar-gen voor het selecteren van getransformeerde planten, deze planten nuttige aanvullingen zouden kunnen zijn op het panel van resistentiegenen tegen pathogenen die gebruikt kunnen worden bij het ontwikkelen van nieuwe verbeterde erwtenlijnen.

De transgene erwtenplanten vertegenwoordigen de eerste peulvruchten die PDR vertonen tegen potyvirussen en enkele van de eerste experimentele voorbeelden in de Leguminosae van planten die PTGS vertonen. Het was daarom waardevol om vast te stellen dat de principes voor PTGS en resistentie in dit systeem overeenkomen met die gekarakteriseerd met meer algemeen gebruikte experimentele planten (b.v. Nicotiana spp.). Zoals verwacht voor PTGS, werd geïnduceerde virusresistentie geassocieerd met de degradatie van transgeen RNA en PSbMV RNA . We toonden ook aan dat PTGS in deze planten werd gemedieerd door een systemisch signaal dat tijdens de beginfase van de virusinfectie werd gegenereerd, en dat dit signaal het potentieel had om de verspreiding van PTGS te mediëren door methylering in de getranscribeerde regio van het NIb-transgen te induceren .

Concluderend hebben we erkend dat de landbouwindustrie baat zou hebben bij het hebben van stabiele en effectieve resistentie tegen PSbMV in erwten. De minst omstreden manier om dit te bereiken zou zijn door het incorporeren van natuurlijk voorkomende resistenties (hetzij tegen zaadoverdracht hetzij tegen virusreplicatie) met gebruikmaking van conventionele veredelingsstrategieën. Ons betrekkelijk geringe inzicht in de genetische complexiteit van PSbMV-zaaizaadoverdracht betekent dat dit op korte termijn waarschijnlijk niet zinvol zal zijn. De sbm-genen zijn veelbelovender, hoewel het ontbreken van nauw verbonden genetische markers en de recessieve aard van de resistentie enige moeilijkheden opleveren. Als alternatief hebben wij aangetoond dat resistentie kan worden gecreëerd door toepassing van transgene technologie, hoewel de kwesties van bioveiligheid en aanvaardbaarheid voor het publiek zullen moeten worden aangepakt. Naast deze toegepaste overwegingen heeft het onderzoek materiaal en kennis opgeleverd die van invloed zullen zijn op de wijze waarop verwante benaderingen in andere gewassen kunnen worden toegepast. Met name het inzicht in de werkingsmechanismen van een nieuwe klasse van genen voor virusresistentie zal van belang zijn.