Discussie

De huidige studie identificeerde een aantal verschillende kenmerken van collaterale EC’s en SMC’s die ten grondslag kunnen liggen aan of bijdragen tot de unieke kenmerken van collateralen zoals geschetst in de inleiding. We ontdekten dat ondanks de lage en oscillerende schuifspanning die aanwezig is in collateralen bij baseline in afwezigheid van obstructie, hun EC’s uitgelijnd zijn met de vaatas in dezelfde mate als aanwezig in distaal-meest arteriolen en de descenderende aorta-vaten met hoge snelheid orthograde laminaire stroming. Endotheelcellen van zowel collateralen als arteriolen hebben primaire cilia, en collateralen bezitten er minder van. Gladde spiercellen van collateralen zijn continu, in tegenstelling tot die van DMA’s. Collateralen hebben hogere expressieniveaus van genen die geassocieerd worden met zowel pro- als anti-inflammatoire en pro- en anti-proliferatie pathways, vergeleken met DMA’s. Een tendens naar een hogere celproliferatie in collaterale cellen wordt ondersteund door de waarneming dat collateralen kort na hun vorming in het embryo tortuositeit beginnen te vertonen, die toeneemt tot op middelbare leeftijd (16 maanden, 49 menselijke jaren-equivalenten). Bovenstaande bevindingen geven inzicht in structurele en moleculaire specialisaties die ten grondslag kunnen liggen aan de unieke kenmerken en functies van collaterale vaten.

Convergentie van bloedstroom in collateralen bij baseline legt lage en “verstoorde” stroom/shear stress krachten op hun mural cellen, dat wil zeggen, ofwel afwezigheid van stroom of zeer lage stroom die heen en weer schommelt (~1-10 keer per minuut) en gemiddeld nul is. Dit resulteert in verhoogde wandspanning volgens de Bernoulli relatie. Wanneer elders in de arteriële circulatie aanwezig, b.v. bij bifurcaties, de binnenboog van de aorta of stroomafwaarts van plaques, bevordert lage en verstoorde shear stress een niet-uitgelijnde cobblestoned EC morfologie die geassocieerd is met verhoogde oxidatieve stress, ontsteking, markers van veroudering, en lage eNOS/NO activiteit (d.w.z., endotheliale disfunctie) . Verrassend genoeg vonden wij echter dat collaterale ECs dezelfde uitlijning (en celafmetingen) hebben als ECs in DMAs en de descenderende aorta. Wij hebben niet onderzocht hoe dit anti-inflammatoire structurele fenotype wordt gespecificeerd. Het is mogelijk dat een of meer van de andere unieke kenmerken die wij hebben geïdentificeerd hierbij betrokken zijn (zie hieronder). Aan de andere kant, de gegevens in figuur 2 voor flow en shear stress werden verkregen in dieren onder narcose. Tijdens het wakkere gedrag kunnen collateralen perioden van aanhoudende stroom in de ene of de andere richting hebben, veroorzaakt door veranderingen in de regionale metabolische activiteit in het gebied dat wordt gevoed door de arteriële bomen die zij met elkaar verbinden. Het is niet bekend of collateralen op deze wijze bijdragen tot de fysiologische metabole regulering van de bloedstroom en de zuurstoftoevoer, d.w.z. de neurovasculaire koppeling in de hersenen en de functionele hyperemie elders. Dergelijke perioden van aanhoudende unidirectionele stroming zouden echter de door ons waargenomen EC-oriëntatie kunnen bevorderen. Ongeacht de onderliggende oorzaak, speculeren wij dat het uitgelijnde fenotype van collaterale EC’s deel uitmaakt (of een marker is) van een groep beschermende mechanismen die het behoud van collateralen bevorderen en hun rarefactie verminderen (figuur 9).

Voor zover wij weten, is dit het eerste verslag waaruit blijkt dat ECs voering collateralen en arteriolen primaire cilia hebben. Ze zijn veel talrijker dan eerder gemeld voor conduit vaten van gezonde personen (dat wil zeggen, afwezig of aanwezig op minder dan 1% van de ECs ): 18% van collaterale ECs hebben PrC vergeleken met 28% voor DMAs. Primaire cilia op ECs werden beschreven in 1984 door Haust in aorta van konijnen en mensen met atherosclerose . Latere rapporten beschreven gecilieerde ECs in haarvaten van de pijnappelklier van een 20 weken oude menselijke foetus, ontwikkelende hart en aortaklep bladen, en referenties daarin], rondom atheromen, ectopisch in de halsslagader van ApoE-/- muizen, en bij gezonde mensen op bifurcaties van conduit slagaders en de binnenbocht van de aortaboog; cilia zijn daarentegen afwezig of bijna afwezig in gebieden van slagaders waar de schuifspanning laminair is. De meeste andere celtypes brengen PrC tot expressie tijdens de ontwikkeling, onder bepaalde condities van celcultuur, en bij volwassenen. Afhankelijk van het celtype nemen PrC deel aan de specificatie van embryo asymmetrie, centriool dispositie, proliferatie / celcyclus regulatie, autofagie, stromingsgevoelige mechanotransductie, chemoceptie, en compartimentering en transport van signaleringseiwitten tussen het ciliaoplasma, cytoplasma, en nucleoplasma (bijv. voor Gli en PDGFRα) . Wanneer cilia aanwezig zijn, zijn ze het talrijkst in niet-prolifererende cellen, met het proximale uiteinde verankerd in een invaginatie van het plasmalemma (ciliaire pocket) in EC’s en andere, maar niet alle celtypes. Primaire cilia zijn gecomplexeerd met de moedercentriool van het basale lichaam, dat verbonden is met het microtubule-organizing center (MTOC). Demontage/resorptie van het cilium tijdens de S-fase en vrijmaking van de centriolen zijn essentieel voor de celdeling . Aangezien PrC via het MTOC verbonden zijn met het cytoskelet, kan de door stroming geïnduceerde buiging van ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire ciliaire cilia door de hele cel worden overgebracht, inclusief naar cel-cel en cel-matrix junctions . Primaire trilharen transduceren vloeistofschuifspanning in renale tubulaire epitheelcellen en EC’s via een route die uitzonderlijk gevoelig is voor schuifspanning en waarbij polycystine-1 en polycystine-2 betrokken zijn, die gecodeerd worden door Pkd1 en Pkd2 . Polycystin-1 heeft mechanosensitieve eigenschappen, terwijl polycystin-2 een TRP calciumkanaal is. Beide eiwitten zijn nodig om schuifspanning waar te nemen en op hun beurt stikstofmonoxide vrij te maken. Defecten in PrC zijn geassocieerd met vele afwijkingen. Mutaties van PKD1 en PKD2 zijn bijvoorbeeld causaal voor autosomaal dominante polycysteuze nierziekte, waarbij nier-EC’s en tubulaire cellen van patiënten een gebrekkige calcium- en NO-reactie en verhoogde proliferatie vertonen.

Primaire cilia zijn afwezig in menselijke navelstreng-ECs die onder laminaire schuifspanning en proliferatieve rust in celcultuur worden gehouden. In menselijke navelstrengaders heeft minder dan één procent van de EC’s cilia die in het lumen uitsteken, terwijl in een groter deel de cilia intracellulair gelokaliseerd zijn. Embryonale aorta en daaruit gekweekte EC’s hebben een enkel cilium dat in het lumen uitsteekt. Endotheliale cilia zijn aanwezig in gebieden met hoge schuifspanning tijdens de embryonale ontwikkeling, samen met expressie van de schuifspanning-gevoelige transcriptiefactor, KLF2, die eNOS en andere anti-inflammatoire en anti-proliferatieve genen transactiveert . In gebieden met lage of verstoorde afschuifspanning zijn PrC gedemonteerd/afwezig en wordt de expressie van Klf2 en eNOS respectievelijk opgeheven en verminderd . Expressie van Klf2 wordt ook geremd in niet-gecilieerde ECs geïsoleerd uit embryonale slagaders, en chemische verwijdering van PrC uit ECs in cultuur heeft een vergelijkbaar effect, d.w.z. afschaffing van Klf2 expressie . Interessant is dat in ECs van volwassen ApoE-/- muizen, die endotheeldisfunctie hebben maar geen plaques ontwikkelen, cilia ectopisch tot expressie komen in de gemeenschappelijke halsslagader ondanks de aanwezigheid van laminaire stroming, in vergelijking met wildtype muizen die verstoken zijn van cilia . Cilia werden verloren wanneer hoge afschuifspanning werd geïnduceerd via implantatie van een stroom-beperkende cast rond het vat. Gieten van de halsslagaders in wildtype muizen induceerde ciliogenese alleen in regio’s van lage en verstoorde afschuifspanning. Deze bevindingen suggereren dat expressie van PrC op ECs in vivo bij volwassenen beperkt is tot gebieden met lage/verstoorde schuifspanning, maar ectopisch kan voorkomen in slagaders met laminaire stroming in aanwezigheid van endotheeldisfunctie veroorzaakt door hyperlipidemie en mogelijk andere vasculaire risicofactoren. Van de nota, in zeer gecilieerde, verstoorde-flow gebieden zoals de binnenste kromming van de aortaboog of stroomafwaarts van plaques, ongeveer 25% van ECs hebben een enkele cilium terwijl de rest verstoken zijn , een percentage vergelijkbaar met wat we waargenomen in arteriolen en collaterals.

Onze bevindingen dat PrC ook aanwezig zijn op arteriolen en collateralen in gezonde jonge volwassen muizen benadrukken de noodzaak van studies die cilia functie in deze vaattypen onderzoeken. Dit omvat het bepalen of onze waarneming van minder cilia op collaterale ECs dan arterioles functionele betekenis heeft. Endotheelcellen zijn mechanisch, elektrisch en diffusioneel gekoppeld aan aangrenzende EC’s en SMC’s, waardoor slechts een fractie van EC’s trilharen hoeft uit te drukken voor transductie van mechano-gevoelige of andere signalen. Hoge afschuifspanning veroorzaakt demontage van cilia in gekweekte ECs, terwijl oscillerende omkering van de stroming hun expressie induceert. Wij speculeren dat cilia op arteriole en collaterale ECs de lagere flow/shear stress in arteriolen en zeer lage en verstoorde flow in collateralen kunnen reflecteren en dat minder PrC op collaterale ECs kunnen dienen om hun gevoeligheid voor de heersende verstoorde shear stress omgeving te verminderen. Met andere woorden, minder cilia op collaterale EC’s kunnen deel uitmaken van een repertoire van aanpassingen die een tegenwicht vormen tegen de laaggradige inflammatoire, oxidatieve, proliferatieve en apoptotische signalen die worden bevorderd door de verstoorde hemodynamische omgeving in collateralen, of die zich daartegen verzetten – door behoud of toename van expressie van KLF2/4, eNOS en andere anti-inflammatoire/anti-proliferatieve factoren (Figuur 9). Egorova et al. stelden iets soortgelijks voor, namelijk dat, aangezien de aanwezigheid van PrC op ECs geassocieerd is met KLF2 expressie, endotheliale trilharen een rem kunnen zetten op EC activatie in regio’s met een lage en verstoorde doorstroming. Een beschermende rol voor cilia in deze gebieden wordt ondersteund door het recente rapport dat verwijdering van endotheliale cilia door voorwaardelijke deletie van Ift88 atherosclerose en inflammatoire genexpressie doet toenemen, en de eNOS activiteit doet afnemen in Apoe-/- muizen die een vetrijk dieet krijgen, en dat het endothelium gevoelig wordt in atherogevoelige gebieden om osteogene differentiatie te ondergaan in Tg737 (orpk/orpk) cilium-defecte muizen. Het is ook mogelijk dat als PrC beschermend zijn, minder cilia in collateralen zouden kunnen bijdragen aan de hoge gevoeligheid van deze vaten voor rarefactie door veroudering en andere vasculaire risicofactoren. Minder cilia in collateralen zou echter ook een secundair of bystander effect kunnen zijn, bijvoorbeeld een gevolg van een hogere inherente proliferatie van collaterale EC’s zoals blijkt uit de progressieve toename van collaterale tortuositeit (hieronder besproken), aangezien de aanwezigheid van PrC en hun associatie met het basale lichaam wordt verondersteld de verwijdering van cellen uit de celcyclus te bevorderen. Toekomstige studies zullen nodig zijn om te bepalen of onze bevinding van meerdere cilia op ECs weerspiegelt ECs die hebben ondergaan proliferatieve senescentie en bijbehorende mislukte cytokinese en nucleaire polyploïdie .

Het is onlangs aangetoond dat ECs in het ontwikkelende netvlies van de muis vertrouwen op PrC om vaatverbindingen te stabiliseren tijdens remodellering van de vasculaire plexus in regio’s met lage tot gemiddelde afschuifspanning . Endotheliale cilia voelen de stroming in zebravisembryo’s, nemen deel aan de rekrutering van mural cellen in arteriële vaten en zijn nodig voor normale vasculaire morfogenese. Het aantal en de diameter van collateralen neemt af vanaf middelbare leeftijd. Deze leeftijd-geïnduceerde rarefactie wordt sterk versneld door genetische of farmacologisch geïnduceerde eNOS / NO deficiëntie of de aanwezigheid van vasculaire risicofactoren . Verhoogde schuifspanning induceert collaterale uitwaartse remodellering na acute of langzaam ontwikkelende arteriële obstructie . Pkd1+/- muizen en patiënten met autosomaal dominante polycysteuze nierziekte hebben endotheliale eNOS/NO disfunctie . Het zal belangrijk zijn om in toekomstige studies te onderzoeken of collaterale PrC deelnemen aan een of meer van de bovenstaande functies met behulp van EC-specifieke knockdown van polycystine-1, aangezien: 1) deficiëntie ervan leidt tot een veranderde ciliaire functie, 2) polycystine-1 samen met polycystine-2 deelneemt aan flow-sensing door PrC, 3) mutante vormen van een van beide eiwitten polycysteuze nierziekte veroorzaken, 4) er aanwijzingen zijn dat VHL, onafhankelijk van zijn rol in de afbraak van Hif1α, samen met GSK3β nodig zijn voor het structurele onderhoud van het cilium , en 5) het eiwit Rabep2, dat nodig is voor collaterogenese , een nieuw substraat is van GSK3β , gelokaliseerd is in het cilium-basaal lichaam complex , en het uitschakelen ervan leidt tot defecte ciliogenese . Andere benaderingen om te interfereren met cilia aanwezigheid en functie, bijvoorbeeld met knockdown van andere ciliaire eiwitten zoals Pkd2 en Ift88, zullen ook moeten worden onderzocht.

In tegenstelling tot distale arteriolen, die schaarse en discontinue SMC’s hebben in verschillende weefsels waaronder retina (we konden geen studies in de hersenen identificeren) , SMC’s waren continu op collateralen. Wij speculeren dat dit een adaptieve toename in wanddikte kan zijn om de toename in circumferentiële wandspanning veroorzaakt door de Bernoulli-specifiek omzetting van kinetische stromingsenergie in verhoogde potentiële energie (transmurale druk) als gevolg van de stromingsconvergentie in collateralen, in evenwicht te brengen. Het zou interessant zijn om te onderzoeken of de samenstelling en hoeveelheid extracellulaire matrix, die de SMC’s zou kunnen helpen bij het compenseren van de verhoogde wandspanning in collateralen, verschilt in collateralen ten opzichte van arteriolen. Ondanks hun verhoogde SMC-dekking, hebben collateralen minder in plaats van meer tonus in vergelijking met arteriolen van vergelijkbare grootte, en missen myogene responsiviteit – bijkomende unieke kenmerken van collaterale vaten.

De verstoorde hemodynamische, pro-oxidatieve omgeving waarin collaterale mural cellen verblijven, leidde ons ertoe te onderzoeken of de expressie van genen betrokken bij ontsteking, celproliferatie, veroudering en angiogenese verschillen voor collaterale vaten versus distale arteriolen. Collateralen vertoonden verhoogde mRNA niveaus voor het pro-inflammatoire, pro-apoptose inflammasoom gen, Pycard, de pro-proliferatieve genen, Ki67, Pdgfb, en Angpt2, het anti-proliferatieve gen, Dll4, en het gedifferentieerde arteriële-type EC merkergen, Ephrinb2. De expressie van celcyclusremmende genen, p21, p27, en p53, was echter niet verschillend, evenmin als andere genen die in verband worden gebracht met proliferatie, celcyclusstilstand, en veroudering (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomerase). Evenmin waren er verschillen in expressie van andere genen geassocieerd met EC en/of SMC proliferatie (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) en die nodig zijn (in het geval van de eerste drie genen) voor de vorming van collateralen tijdens de ontwikkeling of betrokken zijn bij het specificeren van EC en SMC differentiatie en quiescentie (Tgfb, Angpt1). De verhoogde expressie door collateralen van de bovengenoemde pro-proliferatie genen is consistent met onze tortuositeitsmetingen, die suggereren dat collaterale mural cellen een hogere proliferatiesnelheid hebben, vergeleken met andere arteriële vaten: collaterale tortuositeit was duidelijk op de eerste dag na de geboorte, bleef toenemen tot middelbare leeftijd, en nam daarna af. Dit laatste gebeurde op hetzelfde moment dat collateralen een afname in aantal en diameter ervaren bij gevorderde veroudering. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat leeftijd-geassocieerde collaterale rarefactie wordt veroorzaakt door proliferatieve senescentie en daaropvolgende apoptose van collaterale EC’s en SMC’s als gevolg van een levenslange verhoging van de proliferatiesnelheid veroorzaakt door de verstoorde hemodynamische en laag zuurstofgehalte in het bloed omgeving waarin collateralen zich bevinden (figuur 9).

Collateralen vertoonden ook verhoogde activiteit van eNOS, waarvan eerdere studies hebben aangetoond dat het rarefactie van collateralen veroorzaakt door veroudering en andere vasculaire risicofactoren tegengaat. eNOS-afgeleid NO remt oxidatieve stress, ontsteking, proliferatie, leukocytenadhesie, bloedplaatjesaggregatie, en cellulaire veroudering en bevordert SMC-relaxatie. Aangezien schuifspanning een gunstige stimulans is voor eNOS-afgeleid NO, kan een toename van eNOS/NO in collateralen met hun lage en verstoorde omgeving voor schuifspanning het effect van factoren die collaterale rarefactie bevorderen, verminderen (afbeelding 9). Evenzo kan gehandhaafde expressie van de EC shear stress-gevoelige transcriptiefactoren, Klf2 en Klf4, in collateralen ondanks hun lage en oscillerende flow, die de expressie van deze factoren elders in de arteriële vasculatuur remt met een verstoorde flow, fungeren als extra “balancerende” factoren of collaterale specialisaties, samen met verhoogde eNOS, uitgelijnde ECs, minder cilia, robuuste SMC dekking, en verhoogde ephrin-B2 en Dll4. Expressie van KLF2 en KLF4, die proliferatie, ontsteking en angiogenese negatief reguleren, eNOS upreguleren, en sterk gedownreguleerd worden op plaatsen van lage en verstoorde shear stress, waren niet verschillend in collateralen versus DMA’s. Interessant is dat PrC Klf2, Klf4, en eNOS expressie bevorderen.

Een beperking van de bovenstaande studies is dat RNA werd verkregen uit ontleedde vaten, die zijn samengesteld uit ECs, SMCs, en, hoewel minder, pericytes, fibroblasten, en inwonende myeloïde cellen. Studies zijn nodig die scheiding van celtypes en onderzoek van een breder scala van genen en hun respectieve eiwitniveaus te gebruiken. De moeilijkheid om collateralen en distale arteriolen manueel in de vereiste aantallen te ontleden, het effect van celdissociatietechnieken op de basisniveaus van RNA en eiwitten, het ontbreken van celcultuurmodellen van “collaterale” EC’s en SMC’s, en het vooralsnog ontbreken van een collateraal-specifiek markergen, sluiten het gebruik van deze benaderingen echter uit. De expressie van verscheidene onderzochte genen is echter specifiek of verrijkt voor EC’s, b.v. Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2, en Klf4. Analyse van gentranscriptie geeft echter niet altijd veranderingen in eiwitniveau of functie weer; daarom kan onderzoek van oxidatieve stress, ontsteking, proliferatie of senescentie markers op eiwitniveau beter verschillen in cellulaire kenmerken weergeven.