Estudios de investigación
En nuestros estudios, hemos examinado un cultivo de la UE, Pisum sativum (guisante). Los guisantes son susceptibles a una amplia gama de virus, incluyendo el virus del mosaico de la enación del guisante, el virus del pardeamiento temprano del guisante y una serie de virus del grupo del virus Y de la patata (Potyviridae). Dentro de este último grupo, el virus del mosaico amarillo de la judía, el virus del mosaico común de la judía, el virus del mosaico del guisante y el virus del mosaico transmitido por las semillas del guisante (PSbMV) son patógenos importantes. En particular, hemos estudiado el PSbMV para el que todos los cultivares comerciales de guisantes son susceptibles. Esta susceptibilidad se ve agravada por el hecho de que este virus no sólo se transmite de planta a planta por su vector áfido, sino que también se transmite verticalmente de generación en generación en la semilla. Esta propiedad ha dado lugar a una grave contaminación de las colecciones de germoplasma de guisantes y proporciona un medio muy eficaz para provocar una infección temprana y generalizada de los cultivos poco después de la germinación de las semillas. Si se tiene en cuenta que una eficacia de transmisión de las semillas de sólo el 0,1% daría lugar a 10.000 infecciones tras la siembra de semillas a 107/hectárea, la importancia de la transmisión de las semillas se hace evidente. En la actualidad, este problema se contrarresta con la realización de pruebas eficaces de muestras de semillas después de la cosecha, mediante la inmunodetección de la proteína de la cubierta del virus, y el rechazo de los lotes de semillas contaminadas. Como alternativa, y dado que la transmisión por semilla en una serie de cultivares de guisantes varía entre el 0 y el 100%, hemos investigado si la resistencia a la transmisión por semilla podría ser criada en líneas de guisantes mejoradas. En los cruces de prueba y en los retrocruzamientos entre líneas que no mostraban ninguna transmisión o una transmisión del 60-80%, la resistencia se comportó como un carácter dominante, aunque en las generaciones F2 y BC2 no segregó como un rasgo mendeliano. La naturaleza cuantitativa del fenotipo sugirió que la transmisión por semilla sería difícil de incluir como rasgo de resistencia en un programa de mejora convencional.
Se ha identificado la resistencia natural al PSbMV en accesiones de guisantes del norte de África y Asia aunque, hasta ahora, estos genes recesivos no han sido introgresados en líneas comerciales. El análisis genético ha demostrado que estos genes están agrupados con otros genes recesivos con diferentes especificidades del virus del guisante en dos lugares del genoma del guisante. Los genes sbm-1, sbm-3 y sbm-4, que confieren resistencia a los patotipos PI, L-l y P4 del PSbMV, respectivamente, están localizados en el cromosoma 6, mientras que sbm-2, que también confiere resistencia al patotipo L-l, está localizado en el cromosoma 2. Aunque esta organización sugiere la conversión local de genes y la translocación entre los cromosomas 2 y 6, otras pruebas sugieren que los dos grupos de genes pueden tener un origen y una función distintos. Utilizando virus híbridos recombinantes hechos entre diferentes patotipos, se ha definido el determinante de avirulencia del virus como la proteína ligada al genoma del virus (VPg) para sbm-1 . Un análisis estructural y funcional del gen sbm-1 es el tema de un proyecto de biotecnología de la CE # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) en el que participan grupos de investigación y la industria de Dinamarca, Finlandia, España y el Reino Unido.
La caracterización del gen sbm-1 proporcionará recompensas intelectuales y prácticas particulares. Dado que aproximadamente el 20% de todos los genes de resistencia a los virus y aproximadamente el 40% de los genes que confieren resistencia a los potyvirus son recesivos, comprender cómo funciona sbm-1 y qué controla la especificidad de los genes adyacentes de resistencia a sbm- y a otros potyvirus será importante para una amplia gama de enfermedades. Sin embargo, el proyecto sbm- también se enfrenta a retos técnicos, sobre todo al tener que lidiar con el tamaño y la redundancia del genoma del guisante. El genoma del guisante tiene aproximadamente 5 x 109 pares de bases por genoma haploide, unas 50 veces mayor que el de Arabidopsis thaliana. No se ha logrado la clonación de genes en el guisante basada en el mapa y aún no se dispone de grandes bibliotecas de inserción. Sin embargo, existe el potencial en sbm-1 de identificar una nueva clase de genes de resistencia. Los genes de resistencia clonados hasta ahora en otras especies se dividen en dos clases. Los genes de resistencia dominantes que funcionan contra virus, hongos y bacterias específicos pertenecen a la clase «NBS-LRR» y median una resistencia hipersensible a la infección. El único gen recesivo que se ha clonado (mlo) media una resistencia no específica al oídio en la cebada y también se asocia con la localización del patógeno en las células muertas. Funcionalmente, Mlo actúa como un regulador negativo de la resistencia constitutiva. En cambio, sbm-1 es específico de la raza (o del patotipo) y no está asociado a la muerte celular. A partir de estas comparaciones, parecen posibles varios mecanismos funcionales para sbm-1. En primer lugar, podemos considerar el sbm-1 como un factor de susceptibilidad dominante, necesario para ayudar a la replicación del virus. Esto encajaría con la probable participación del VPg en la replicación del ARN viral y la observación de que los protoplastos de plantas resistentes no muestran una replicación del virus detectable. En segundo lugar, al igual que Mlo, Sbm-1 podría actuar como regulador negativo de la resistencia, aunque las diferencias de especificidad con respecto a mlo situarían a sbm-1 en una clase distinta de genes de resistencia. En tercer lugar, sbm-1 podría ser un alelo de resistencia débil dominante pero dependiente de la dosis. Nos inclinamos por la primera opción como la interpretación más directa y sencilla.
Para nuestro componente en el proyecto de biotecnología de la CE hemos optado por utilizar enfoques genéticos para identificar el producto del gen de resistencia sbm-1. Tras identificar las líneas de guisantes adecuadas (un par de líneas BC4 portadoras de alelos homocigóticos de resistencia y susceptibilidad) se ha utilizado una estrategia de cDNA-AFLP para identificar los genes expresados procedentes de la región introgresada. Hasta ahora, se han identificado diez ADNc polimórficos. Estos se están mapeando utilizando familias endogámicas recombinantes para confirmar su origen genómico. Nuestra estrategia alternativa consiste en «pescar» el producto del gen sbm-1 utilizando el sistema de dos híbridos de levadura con la proteína VPg del PSbMV como cebo. Se han identificado dos cDNAs candidatos fuertes y otros ocho cDNAs que codifican proteínas interactuantes a partir de una biblioteca de cDNAs de guisantes hecha a partir de una línea de guisantes susceptibles. Estos cDNAs también están siendo secuenciados y mapeados.
Como parte de un proyecto anterior de EC-AIR (# CT94-1171) en el que participaron socios académicos e industriales de Dinamarca, Francia y el Reino Unido, también hemos explorado el potencial de desarrollo de PDR a PSbMV en guisantes transgénicos. Dado que en otros sistemas el gen de la replicasa viral se había utilizado comúnmente para dar PDR desencadenando el proceso de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), utilizamos el cistrón de la replicasa del PSbMV (NIb) para la expresión transgénica en guisantes . A partir de 35 líneas de guisantes, transformadas con ADN T de Agrobacterium tumefaciens que portaban una construcción promotora 35S -Nib – 35S terminadora, y el gen bar como marcador seleccionable para el tejido transformado en presencia del herbicida Bialophos, se demostró que tres líneas eran resistentes al PSbMV. Dos de estas líneas llevaban una repetición directa del extremo 3′ del gen Nib (NIbIb), ya que había algunas pruebas de que las disposiciones complejas de transgenes tenían más potencial para iniciar la PTGS. Todas estas líneas mostraban un tipo de PDR denominado «recuperación», en el que la inoculación de desafío da lugar a una infección inicial, pero las plantas se recuperan rápidamente y no muestran más síntomas ni acumulación de virus. Los tejidos recuperados son entonces resistentes a una nueva provocación con los aislados de virus homólogos o estrechamente relacionados. Para evaluar la importancia de esto en el campo, donde las plantas pueden ser desafiadas con una población de virus relacionados, se evaluó la capacidad de diferentes aislados de PSbMV para desencadenar PTGS y para ser blanco de PTGS inducidos. Esto demostró que los virus con aproximadamente un 89% o más de identidad en el cistrón NIb podían inducir la resistencia, aunque los requisitos de especificidad para que un segundo virus de desafío se considere un objetivo pueden ser mayores. Como referencia, los dos aislados de PSbMV con secuencias más divergentes difieren en un 89% en la región Nib. Esta distinción en los requisitos de especificidad para la activación y la focalización en PTGS será una consideración importante para la aplicación de la tecnología a los cultivos comerciales. La resistencia relativamente amplia a los aislados del PSbMV en los guisantes transgénicos Nib contrasta con la extrema especificidad del patotipo observada para los genes naturales de resistencia al sbm, donde sólo uno o unos pocos cambios en el determinante de avirulencia del virus son suficientes para cambiar un aislado del PSbMV de avirulento a virulento.
A pesar del corto período de infección inicial, las plantas de guisantes transgénicos mostraron un buen crecimiento y cuajado de semillas después de la inoculación de desafío para dar rendimientos en condiciones de invernadero equivalentes a los observados en las líneas transgénicas o no transgénicas no infectadas. Creemos que, a reserva de los acuerdos de licencia que cubren el uso del gen de la barra para la selección de plantas transformadas, estas plantas podrían ser adiciones útiles al panel de genes de resistencia a patógenos que se utilizará en el desarrollo de nuevas líneas de guisantes mejoradas.
Las plantas de guisantes transgénicos representan las primeras leguminosas que muestran PDR contra potyvirus y algunos de los primeros ejemplos experimentales en las Leguminosae de plantas que muestran PTGS. Por lo tanto, fue valioso establecer que los principios que rigen la PTGS y la resistencia en este sistema respaldaban los caracterizados con plantas experimentales más comúnmente utilizadas (por ejemplo, Nicotiana spp.). Como se esperaba para el PTGS, la resistencia inducida al virus se asoció con la degradación del ARN del transgén y del ARN del PSbMV . También demostramos que la PTGS estaba mediada en estas plantas por una señal sistémica generada durante la fase inicial de la infección del virus, y que esta señal tenía el potencial de mediar en la propagación de la PTGS mediante la inducción de la metilación en la región transcrita del transgén NIb .
En conclusión, hemos reconocido que la industria agrícola se beneficiaría de tener una resistencia estable y efectiva al PSbMV en los guisantes. La vía menos conflictiva para conseguirlo sería la incorporación de resistencias naturales (ya sea a la transmisión de semillas o a la replicación del virus) utilizando estrategias de mejora convencionales. Nuestro relativamente escaso conocimiento de la complejidad genética de la transmisión por semilla del PSbMV significa que es poco probable que esto sea útil a corto plazo. Los genes sbm- son más prometedores, aunque la falta de marcadores genéticos estrechamente vinculados y la naturaleza recesiva de la resistencia crean algunas dificultades. Por otra parte, hemos demostrado el potencial de crear resistencia mediante la aplicación de la tecnología transgénica, aunque habrá que abordar las cuestiones de bioseguridad y aceptabilidad pública. Además de estas consideraciones aplicadas, la investigación ha generado y está generando materiales y conocimientos que influirán en la forma de utilizar enfoques relacionados en otras plantas de cultivo. En particular, será importante comprender los mecanismos de acción de una nueva clase de genes de resistencia a los virus.