Discusión

El presente estudio identificó una serie de características distintas de las CE y las CML colaterales que pueden subyacer o contribuir a las características únicas de las colaterales descritas en la Introducción. Descubrimos que, a pesar de la tensión de cizallamiento baja y oscilante presente en las colaterales en la línea de base en ausencia de obstrucción, sus CE están alineadas con el eje del vaso en el mismo grado presente en las arteriolas más distales y en los vasos de la aorta descendente con flujo laminar ortógrado de alta velocidad. Las células endoteliales tanto de las colaterales como de las arteriolas tienen cilios primarios, y las colaterales poseen menos de ellos. Las células musculares lisas de las colaterales son continuas, a diferencia de las de las AMD. Las colaterales tienen niveles más altos de expresión de genes asociados con las vías pro y antiinflamatorias y pro y antiproliferación, en comparación con las AMD. La observación de que las colaterales comienzan a adquirir tortuosidad poco después de su formación en el embrión y que ésta aumenta hasta la edad media (16 meses, 49 años equivalentes en humanos) corrobora la existencia de un sesgo hacia una mayor tasa de proliferación celular en las células murales colaterales. Los hallazgos anteriores proporcionan información sobre las especializaciones estructurales y moleculares que pueden subyacer a las características y funciones únicas de los vasos colaterales.

La convergencia del flujo sanguíneo en las colaterales en la línea de base impone fuerzas de flujo/estrés de cizallamiento bajas y «perturbadas» en sus células murales, es decir, ausencia de flujo o un flujo muy bajo que oscila de un lado a otro (~1-10 veces por minuto) y tiene un promedio de cero. Esto da lugar a un aumento de la tensión mural según la relación de Bernoulli. Cuando está presente en otras partes de la circulación arterial, por ejemplo, en las bifurcaciones, el arco interno de la aorta o aguas abajo de las placas, la tensión de cizallamiento baja y perturbada favorece una morfología no alineada de las CE que se asocia con un aumento del estrés oxidativo, la inflamación, los marcadores de envejecimiento y la baja actividad de la eNOS/NO (es decir, la disfunción endotelial) . Sin embargo, sorprendentemente, descubrimos que las CE colaterales tienen la misma alineación (y dimensiones celulares) que las CE de las AMD y de la aorta descendente. No investigamos cómo se especifica este fenotipo estructural antiinflamatorio. Es posible que estén implicadas una o varias de las otras características únicas que hemos identificado (véase más adelante). Por otra parte, los datos de la Figura 2 para el flujo y el esfuerzo cortante se obtuvieron en animales anestesiados. Durante los comportamientos despiertos, las colaterales pueden tener períodos de flujo sostenido en una u otra dirección inducidos por cambios en la actividad metabólica regional en el territorio abastecido por los árboles arteriales que conectan. No se sabe si las colaterales contribuyen de este modo a la regulación metabólica fisiológica del flujo sanguíneo y el suministro de oxígeno, es decir, al acoplamiento neurovascular en el cerebro y a la hiperemia funcional en otros lugares. Sin embargo, tales períodos de flujo unidireccional sostenido podrían promover la orientación de las CE que observamos. Independientemente de la causa subyacente, especulamos que el fenotipo alineado de las CE colaterales forma parte (o es un marcador) de un grupo de mecanismos protectores que favorecen el mantenimiento de las colaterales y mitigan su rarefacción (Figura 9).

Hasta donde sabemos, este es el primer informe que muestra que las CE que recubren las colaterales y las arteriolas tienen cilios primarios. Son mucho más abundantes de lo que se había informado anteriormente para los vasos de conducto de individuos sanos (es decir, ausentes o presentes en menos del 1% de las CE): el 18% de las CE colaterales tienen PrC en comparación con el 28% de las DMA. Los cilios primarios en las CE fueron descritos en 1984 por Haust en la aorta de conejos y humanos con aterosclerosis. En informes posteriores se describieron CE ciliadas en los capilares de la glándula pineal de un feto humano de 20 semanas de edad, en el corazón en desarrollo y en las valvas de la válvula aórtica, y en las referencias de los mismos], en los alrededores de los ateromas, de forma ectópica en la arteria carótida común de ratones ApoE-/-, y en individuos sanos en las bifurcaciones de las arterias de conducción y en la curvatura interna del arco aórtico; por el contrario, los cilios están ausentes o casi ausentes en las regiones de las arterias donde la tensión de cizallamiento es laminar. La mayoría de los demás tipos celulares expresan PrC durante el desarrollo, en determinadas condiciones de cultivo celular y en los adultos. Dependiendo del tipo de célula, los PrC participan en la especificación de la asimetría embrionaria, la disposición de los centríolos, la proliferación/regulación del ciclo celular, la autofagia, la mecanotransducción sensible al flujo, la quimiocepción y la compartimentación y el tráfico de proteínas de señalización entre el cilioplasma, el citoplasma y el nucleoplasma (por ejemplo, para Gli y PDGFRα). Cuando están presentes, los cilios son más abundantes en las células no proliferativas, con el extremo proximal anclado en una invaginación del plasmalema (bolsillo ciliar) en las CE y en otros tipos celulares, pero no en todos. Los cilios primarios forman un complejo con el centríolo madre del cuerpo basal que se une al centro organizador de microtúbulos (MTOC) . El desmontaje/reabsorción del cilio durante la fase S y la liberación del centríolo son esenciales para la división celular . Dado que los PrC están unidos al citoesqueleto a través del MTOC, la flexión ciliar inducida por el flujo en las CE es capaz de transmitirse a toda la célula, incluso a las uniones célula-célula y célula-matriz . Los cilios primarios transducen la tensión de cizallamiento del fluido en las células epiteliales tubulares renales y en las CE a través de una vía que es excepcionalmente sensible a la tensión de cizallamiento y en la que participan la policistina-1 y la policistina-2, codificadas por Pkd1 y Pkd2 . La policistina-1 tiene propiedades mecanosensibles, mientras que la policistina-2 es un canal de calcio TRP. Ambas proteínas son necesarias para detectar la tensión de cizallamiento y, a su vez, liberar óxido nítrico. Los defectos en la PrC están asociados a muchas anomalías. Por ejemplo, las mutaciones de PKD1 y PKD2 son causantes de la enfermedad renal poliquística autosómica dominante, y las CE renales y las células tubulares de los pacientes presentan respuestas deficientes al calcio y al NO y una mayor proliferación .

Los cilios primarios están ausentes en las CE de la vena umbilical humana mantenidas bajo tensión de cizallamiento laminar y quiescencia proliferativa en cultivo celular. En las venas umbilicales humanas menos del uno por ciento de las CE tienen cilios que sobresalen en el lumen, mientras que en una fracción mayor los cilios se localizan intracelularmente . La aorta embrionaria y las CE cultivadas a partir de ella tienen un único cilio que se proyecta hacia el lumen . Los cilios endoteliales están presentes en regiones de alta tensión de cizallamiento durante el desarrollo embrionario, junto con la expresión del factor de transcripción sensible a la tensión de cizallamiento, KLF2, que transactiviza la eNOS y otros genes antiinflamatorios y antiproliferativos . En las regiones con una tensión de cizallamiento baja o perturbada, la PrC está desensamblada/ausente y la expresión de Klf2 y eNOS está abolida y reducida, respectivamente . La expresión de Klf2 también se inhibe en las CE no ciliadas aisladas de arterias embrionarias, y la eliminación química de la PrC de las CE en cultivo tiene un efecto similar, es decir, la abolición de la expresión de Klf2 . Curiosamente, en las CE de ratones ApoE-/- adultos, que presentan disfunción endotelial pero no desarrollan placas, los cilios se expresan de forma ectópica en la arteria carótida común a pesar de la presencia de flujo laminar, en comparación con los ratones de tipo salvaje que carecen de cilios . Los cilios se pierden cuando se induce una alta tensión de cizallamiento mediante la implantación de un molde que restringe el flujo alrededor del vaso. El enyesado de las carótidas comunes en los ratones de tipo salvaje indujo la ciliogénesis sólo en las regiones de tensión de cizallamiento baja y perturbada. Estos resultados sugieren que la expresión de la PrC en las CE in vivo en adultos se limita a las regiones de tensión de cizallamiento baja/perturbada, pero puede producirse ectópicamente en las arterias con flujo laminar en presencia de una disfunción endotelial causada por la hiperlipidemia y posiblemente por otros factores de riesgo vascular. Cabe destacar que en zonas de flujo perturbado altamente ciliadas, como la curvatura interna del arco aórtico o aguas abajo de las placas, aproximadamente el 25% de las CE tienen un solo cilio mientras que el resto están desprovistas , un porcentaje similar al que observamos en arteriolas y colaterales.

Nuestros hallazgos de que los PrC también están presentes en las arteriolas y colaterales en ratones adultos jóvenes sanos destacan la necesidad de realizar estudios que examinen la función de los cilios en estos tipos de vasos. Esto incluye determinar si nuestra observación de un menor número de cilios en las CE colaterales que en las arteriolas tiene un significado funcional. Las células endoteliales están acopladas mecánica, eléctrica y difusionalmente a las CE y CML adyacentes, por lo que es posible que sólo una fracción de las CE necesite expresar cilios para la transducción de señales mecanosensibles o de otro tipo. La alta tensión de cizallamiento provoca el desmontaje de los cilios en las CE cultivadas, mientras que la inversión oscilatoria del flujo induce su expresión. Especulamos que los cilios de las CE de las arteriolas y de las colaterales pueden reflejar el menor flujo/estrés de cizallamiento en las arteriolas y el flujo muy bajo y perturbado en las colaterales, y que un menor número de PrC en las CE de las colaterales puede servir para reducir su sensibilidad al entorno de estrés de cizallamiento perturbado predominante. En otras palabras, un menor número de cilios en las CE colaterales puede formar parte de un repertorio de adaptaciones que equilibran o se oponen -mediante el mantenimiento o el aumento de la expresión de KLF2/4, eNOS y otros factores antiinflamatorios/antiproliferativos- a las señales inflamatorias, oxidativas, proliferativas y apoptóticas de bajo grado promovidas por el entorno hemodinámico alterado presente en las colaterales (figura 9). Egorova et al. propusieron algo similar, es decir, que dado que la presencia de PrC en las CE está asociada a la expresión de KLF2, los cilios endoteliales pueden señalar un freno a la activación de las CE en regiones de flujo bajo y perturbado. La función protectora de los cilios en estas regiones está respaldada por el reciente informe de que la eliminación de los cilios endoteliales mediante la deleción condicional de Ift88 aumentó la aterosclerosis y la expresión de genes inflamatorios, y disminuyó la actividad de la eNOS en los ratones Apoe-/- alimentados con una dieta alta en grasas , y que el endotelio se sensibiliza en las regiones propensas a la aterosclerosis para someterse a la diferenciación osteogénica en los ratones Tg737 (orpk/orpk) con defectos en los cilios . También es posible que si los PrC son protectores, un menor número de ellos en las colaterales podría contribuir a la alta susceptibilidad de estos vasos a la rarefacción por el envejecimiento y otros factores de riesgo vascular. Sin embargo, un menor número de cilios en las colaterales podría reflejar simplemente un efecto secundario o de transeúnte, siendo una consecuencia, por ejemplo, de una mayor tasa de proliferación inherente de las CE colaterales, tal y como demuestra el aumento progresivo de la tortuosidad de las colaterales (que se discute más adelante), ya que se cree que la presencia de PrC y su asociación con el cuerpo basal favorecen la eliminación de las células del ciclo celular . Serán necesarios futuros estudios para determinar si nuestro hallazgo de múltiples cilios en las CE refleja CE que han sufrido senescencia proliferativa y citoquinesis fallida asociada y poliploidía nuclear .

Recientemente se ha demostrado que las CE de la retina de ratón en desarrollo dependen de la PrC para estabilizar las conexiones de los vasos durante la remodelación del plexo vascular en regiones con una tensión de cizallamiento de baja a intermedia . Los cilios endoteliales detectan el flujo en embriones de pez cebra, participan en el reclutamiento de células murales a los vasos con destino arterial y son necesarios para la morfogénesis vascular normal. El número y el diámetro de las colaterales disminuye a partir de la mediana edad. Esta rarefacción inducida por la edad se ve fuertemente acelerada por la deficiencia de eNOS/NO inducida genética o farmacológicamente o por la presencia de factores de riesgo vascular . El aumento de la tensión de cizallamiento induce la remodelación externa de las colaterales tras una obstrucción arterial aguda o de desarrollo lento. Los ratones Pkd1+/- y los pacientes con poliquistosis renal autosómica dominante presentan una disfunción de la eNOS/NO endotelial. Será importante examinar en futuros estudios si la PrC colateral participa en una o más de las funciones mencionadas utilizando el knockdown específico de la CE de la policistina-1, ya que 1) su deficiencia conduce a una alteración de la función ciliar, 2) la policistina-1 junto con la policistina-2 participan en la detección del flujo por parte de la PrC, 3) las formas mutantes de cualquiera de las dos proteínas causan la enfermedad renal poliquística , 4) hay pruebas de que la VHL, independientemente de su papel en la degradación de Hif1α junto con GSK3β son necesarios para el mantenimiento estructural del cilio, y 5) la proteína Rabep2, necesaria para la colaterogénesis, es un nuevo sustrato de GSK3β, se localiza en el complejo cilio-cuerpo basal, y su eliminación conduce a una ciliogénesis defectuosa. También habrá que examinar otros enfoques para interferir en la presencia y función de los cilios, por ejemplo, con el knockdown de otras proteínas ciliares como Pkd2 e Ift88.

En contraste con las arteriolas distales, que tienen SMCs escasas y discontinuas en varios tejidos incluyendo la retina (no pudimos identificar estudios en el cerebro) , las SMCs eran continuas en las colaterales. Especulamos que esto puede ser un aumento adaptativo del grosor de la pared para equilibrar el aumento de la tensión de la pared circunferencial causada por la conversión especificada por Bernoulli de la energía cinética del flujo en un aumento de la energía potencial (presión transmural) como consecuencia de la convergencia del flujo en las colaterales. Sería interesante examinar si la composición y la cantidad de matriz extracelular, que podría ayudar a las CML a equilibrar la mayor tensión de la pared en las colaterales, difiere en las colaterales frente a las arteriolas. Cabe destacar que, a pesar de su mayor cobertura de SMC, las colaterales tienen menos tono, en lugar de más, en comparación con las arteriolas de tamaño similar, y carecen de capacidad de respuesta miogénica, características únicas adicionales de los vasos colaterales.

El entorno hemodinámico perturbado y pro-oxidativo en el que residen las células murales colaterales nos llevó a examinar si la expresión de los genes implicados en la inflamación, la proliferación celular, el envejecimiento y la angiogénesis difiere en las colaterales frente a las arteriolas distales. Las colaterales mostraron mayores niveles de ARNm para el gen proinflamatorio y proapoptosis del inflamasoma, Pycard, los genes proproliferativos, Ki67, Pdgfb y Angpt2, el gen antiproliferativo, Dll4, y el gen marcador de CE de tipo arterial diferenciado, Ephrinb2. Sin embargo, la expresión de los genes inhibidores del ciclo celular, p21, p27 y p53, no fue diferente, como tampoco lo fueron otros genes asociados a la proliferación, la detención del ciclo celular y el envejecimiento (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomerasa). Tampoco hubo diferencias en la expresión de otros genes asociados a la proliferación de CE y/o SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) y que son necesarios (en el caso de los tres primeros genes) para la formación de colaterales durante el desarrollo o están implicados en la especificación de la diferenciación y quiescencia de CE y SMC (Tgfb, Angpt1). La mayor expresión en las colaterales de los genes pro-proliferación mencionados anteriormente es coherente con nuestras mediciones de tortuosidad, que sugieren que las células murales de las colaterales tienen una mayor tasa de proliferación, en comparación con otros vasos arteriales: la tortuosidad de las colaterales era evidente desde el primer día después del nacimiento, continuó aumentando hasta la edad media, y luego disminuyó. Esto último ocurrió al mismo tiempo que las colaterales experimentan un descenso en número y diámetro con el envejecimiento avanzado . Estos resultados apoyan la hipótesis de que la rarefacción de las colaterales asociada a la edad está causada por la senescencia proliferativa y la posterior apoptosis de las CE y las CML colaterales debido a una elevación de la tasa de proliferación a lo largo de la vida causada por el entorno hemodinámico alterado y de bajo contenido de oxígeno en sangre en el que residen las colaterales (figura 9).

Las colaterales también mostraron un aumento de la actividad de la eNOS, que según estudios anteriores se opone a la rarefacción de las colaterales causada por el envejecimiento y otros factores de riesgo vascular . El NO derivado de la eNOS inhibe el estrés oxidativo, la inflamación, la proliferación, la adhesión de leucocitos, la agregación plaquetaria y el envejecimiento celular y promueve la relajación de las CML . Dado que el estrés de cizallamiento es un estímulo próximo para el NO derivado de la eNOS, el aumento de la eNOS/NO en las colaterales con su entorno de estrés de cizallamiento bajo y perturbado puede disminuir el efecto de los factores que promueven la rarefacción de las colaterales (Figura 9). Asimismo, el mantenimiento de la expresión de los factores de transcripción sensibles a la tensión de cizallamiento de las CE, Klf2 y Klf4, en las colaterales a pesar de su flujo bajo y oscilante, que inhibe la expresión de estos factores en otras partes de la vasculatura arterial con flujo perturbado, puede actuar como factores adicionales de «equilibrio» o especialización de las colaterales, junto con el aumento de la eNOS, la alineación de las CE, el menor número de cilios, la cobertura robusta de las CML y el aumento de la efrina-B2 y la Dll4. La expresión de KLF2 y KLF4, que regulan negativamente la proliferación, la inflamación y la angiogénesis, regulan al alza la eNOS y están fuertemente regulados a la baja en sitios de tensión de cizallamiento baja y perturbada, no fueron diferentes en las colaterales frente a las DMA. Curiosamente, la PrC promueve la expresión de Klf2, Klf4 y eNOS.

Una limitación de los estudios anteriores es que el ARN se obtuvo de vasos disecados, que están compuestos por CE, SMC y, aunque en menor medida, pericitos, fibroblastos y células mieloides residentes. Se necesitan estudios que empleen la separación de los tipos de células y el examen de una gama más amplia de genes y sus respectivos niveles de proteínas. Sin embargo, la dificultad de disecar manualmente las colaterales y las arteriolas distales en el número necesario, el efecto de las técnicas de disociación celular en los niveles de referencia de ARN y proteínas, la ausencia de modelos de cultivo celular de CE y CML «colaterales», y la falta todavía de un gen marcador específico de las colaterales, impiden el uso de estos enfoques. No obstante, cabe destacar que la expresión de varios de los genes examinados es específica o está enriquecida para las CE, por ejemplo, Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 y Klf4. Sin embargo, el análisis de la transcripción de los genes no siempre refleja los cambios en el nivel o la función de las proteínas; por lo tanto, la investigación de los marcadores de estrés oxidativo, inflamación, proliferación o senescencia a nivel de las proteínas puede reflejar mejor las diferencias en las características celulares.