Cultura de células, amplificação e purificação de vírus para experimentos SHAPE-MaP e SPLASH

Células de Rim Bovino Madin-Darby (MDBK) e Rim Canino Madin-Darby (MDCK) foram cultivadas em Meio Mínimo Essencial (Merck), suplementadas com 2 mM de l-glutamina e 10% de FCS. Os estoques do vírus WSN (H1N1) foram produzidos infectando as células MDBK com o vírus da influenza em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01. Estoques virais dos vírus Udorn (H3N2) e PR8 (H1N1) (PR8) foram produzidos pela infecção de células MDCK com MOI de 0,001 na presença de 0,8 μg ml-1 de n-Tosyl-l-fenilalanina clorometil-cetona (TPCK)-treated trypsin (Merck). Os vírus foram coletados 2 d pós-infecção. Os vírus foram purificados por ultracentrifugação: primeiro, o meio de cultura celular infectado foi clarificado por centrifugação a 4.000 r.p.m. durante 10 min a 4 °C, seguido de centrifugação a 10.000 r.p.m. durante 15 min a 4 °C. O vírus foi então purificado por centrifugação através de uma almofada de sacarose a 30% a 25.000 r.p.m. durante 90 min a 4 °C num rotor SW 32 (Beckman Coulter). O sedimento purificado do vírus foi ressuspendido em um tampão de ressuspensão (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Observamos que nem o virião nem as estruturas terciárias de RNA são perturbadas por ultracentrifugação30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP foi realizada de acordo com os procotols17 publicados; o anidrido 1-metil-7-nitroisatóico (1M7) foi sintetizado a partir do anidrido 4-nitroisatóico como descrito anteriormente33. Para os experimentos de RNA transcritos in vitro, cada segmento de RNA viral foi sintetizado a partir de um modelo de DNA linear usando o HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Os produtos foram verificados quanto ao tamanho e pureza em um gel de eletroforese de 3,5% de poliacrilamida (PAGE)-urea gel. As amostras de RNA viral nu foram preparadas purificando as partículas de WSN sobre a almofada de sacarose, como descrito anteriormente. Os vírus purificados foram tratados com 250 μg ml-1 de Proteinase K (Roche) em tampão de proteinase K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) durante 40 min a 37 °C. Antes da modificação, as amostras de RNA transcrito in vitro e RNA viral nu foram dobradas a 37 °C durante 30 min em tampão dobrável (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). 1M7 (dissolvido em dimetilsulfóxido anidro (DMSO; Merck)) foi adicionado a uma concentração final de 10 mM ao RNA dobrado e as amostras foram incubadas durante 75 s a 37 °C. As modificações no virio foram realizadas adicionando 1M7 diretamente ao vírus purificado. A capacidade dos reagentes SHAPE-MaP de penetrar as partículas virais foi inicialmente testada como descrito anteriormente34 através da realização de extensões de primer com 32P no RNA extraído do vírus SHAPE-MaP reagent-treated virus utilizando um primer de segment-targeting de NA (5′-AATTGGGTTCCAAAGGAGACG-3′). Em paralelo às amostras tratadas com 1M7, as amostras de controlo foram tratadas com DMSO. O anidrido n-metilisatoico (NMIA; Thermo Fisher Scientific) reagente SHAPE-MaP também foi testado em virio. Experimentos com NMIA foram realizados conforme descrito para 1M7, exceto os virions purificados foram tratados com NMIA por 45 min.

A preparação da biblioteca de sequenciamento foi realizada conforme descrito anteriormente17 de acordo com o fluxo de trabalho mais aleatório. Em resumo, após 1M7 ou tratamento de controle, o RNA foi purificado usando o Kit RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research). O RNA foi transcrito de forma inversa usando a mistura de primer aleatório (New England Biolabs) com SuperScript II (Invitrogen) em tampão MaP (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol e 0.5 mM de deoxinucleoside trifosfato). O Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) foi usado para preparar as bibliotecas de DNA. Os produtos finais de amplificação PCR foram seleccionados usando o Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) e avaliados com o kit Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) num Sistema Bioanalisador 2100 (Agilent Technologies). Para WSN, RNA viral nu e RNA transcrito in vitro, as bibliotecas foram sequenciadas (2 × 150 pares de bases (bp)) num Sistema HiSeq 4000 (Illumina); para vírus PR8 e Udorn, as bibliotecas foram sequenciadas (1 × 150 bp) num Sistema NextSeq 500 (Illumina).

SPLASH

SPLASH foram preparadas amostras conforme publicadas anteriormente24,35, com algumas modificações, para duas réplicas de cada um dos vírus WSN, PR8 e Udorn e uma única réplica para cada um dos vírus reortantes H3N2. O vírus purificado foi incubado com 200 μM de EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina (Thermo Fisher Scientific) e 0,01% de digitonina (Merck) por 5 minutos a 37 °C. O vírus foi espalhado em um prato de 6 poços, coberto com uma placa de vidro, colocado sobre gelo e irradiado por 45 min usando uma Lâmpada UVP Ultra Violeta (Thermo Fisher Scientific). O vírus Crosslinked foi tratado com proteinase K e o RNA viral foi extraído com TRIzol (Invitrogen). Uma alíquota do RNA viral extraído foi usada para detectar a incorporação de biotina usando um Kit de Detecção de Ácido Núcleo Quimioluminescente (Thermo Fisher Scientific) em uma Membrana de Nylon Hybond-N (GE Healthcare Life Sciences). O restante do RNA viral extraído foi fragmentado utilizando o Módulo de Fragmentação de RNA de Magnésio NEBNext (New England Biolabs) e selecionado para fragmentos menores que 200 nt utilizando o Kit RNA Clean & Concentrator-5. As amostras foram enriquecidas para RNA viral biotinilado utilizando contas Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific); a ligação de proximidade em esferas e a inversão psoralen-cross-link foram realizadas conforme publicado anteriormente24,35. Foram preparadas bibliotecas de sequenciação utilizando o kit comercial SMARTer smRNA-Seq (Clontech Laboratories). A seleção do tamanho final foi feita executando as bibliotecas de sequenciamento amplificadas por PCR em um gel PAGE 6% (Thermo Fisher Scientific) em Tris/ácido bórico/EDTA (TBE), selecionando para 200-300 bp DNA. As bibliotecas foram sequenciadas 1 × 150 bp num sistema NextSeq 500.

Processamento da sequenciação SHAPE-MaP lê-se

Leituras de sequenciação foram aparadas para remover adaptadores usando Skewer v0.2.2 (ref. 36). Os perfis de reatividade do SHAPE-MaP foram gerados usando o gasoduto ShapeMapper2 publicado37, que alinha as leituras ao genoma de referência e calcula as taxas de mutação em cada posição de nucleotídeo. As taxas de mutação são então convertidas para os valores de reatividade SHAPE-MaP definidos como:

onde mutr1M7 é a taxa de mutação de nucleotídeos na amostra tratada com 1M7 e mutrDMSO é a taxa de mutação na amostra tratada com DMSO. Todas as reatividades SHAPE-MaP foram normalizadas a uma escala aproximada de 0-2 dividindo os valores de reatividade SHAPE-MaP pela reatividade média dos 10% de nucleotídeos mais altamente reativos após excluir os outliers (definidos como nucleotídeos com valores de reatividade que são >1,5 o intervalo interquartílico). As reatividades SHAPE-MaP altas indicam regiões de RNA mais flexíveis (ou seja, de cadeia única) e as reatividades SHAPE-MaP baixas indicam regiões de RNA mais restritas estruturalmente (ou seja, de cadeia base).

Processamento de seqüenciamento SPLASH lêem

Leituras de seqüenciamento foram aparadas para remover adaptadores usando Skewer v0.2.2 (ref. 36). STAR v.2.5.3 (ref. 38) foi usado para alinhar as leituras com o genoma de referência do vírus apropriado (Tabela Complementar 2). Somente as leituras quiméricas onde pelo menos 20 nt alinhadas aos segmentos de referência foram usadas no processamento posterior (parâmetro STAR: -chimSegmentMin 20). As leituras quiméricas foram deduplicadas usando cadeias CIGAR e posições de alinhamento. As cordas CIGAR em cada alinhamento lido foram processadas para encontrar as coordenadas de início e fim da leitura. As coordenadas de leitura quiméricas foram usadas para produzir uma matriz de interações de seqüência no software R. Loci discretos na matriz foram selecionados e ajustados individualmente com uma curva Gaussiana baseada na intensidade de sobreposição de leitura para definir uma janela de interação; janelas de interação de loci complexos sobrepostos foram separadas em janelas individuais. A largura da janela de interação foi usada para determinar as coordenadas de início e fim de cada interação; o número de leituras que estavam dentro (ou parcialmente dentro) desta região foi usado como uma medida da freqüência de interação. Para a geração dos números, as 20 principais interações em cada vírus foram visualizadas usando o pacote circlize v.0.4.5 (ref. 39) no R v.3.5.1. O conjunto completo de loci de interação é fornecido na Tabela Complementar 2. Para validação dos loci de interação qPCR, amostras psoralen-cross-linked foram preparadas e enriquecidas como descrito anteriormente, mas com um tempo de fragmentação reduzido (3 versus 4 min) para gerar fragmentos de RNA mais longos. O RNA foi poliadenilado com Polimerase (Takara Bio) e o DNA complementar foi gerado usando o primer smRNA dT (Takara Bio) e PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) de acordo com as instruções do fabricante. Um qPCR de 50 ciclos foi realizado de acordo com as instruções do fabricante num instrumento StepOnePlus (Applied Biosystems) usando o Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix com ROX (Agilent Technologies) e pares de primers para testar intersegmentos. As sequências de iniciadores são apresentadas na Tabela Complementar 3. Após 50 ciclos de amplificação qPCR, os produtos foram resolvidos por 8% PAGE (29:1 acrilamida/bis-acrilamida, 1× tampão TBE) e visualizados com transiluminação de luz azul.

Previsão da estrutura do RNA

O algoritmo IntaRNA v.2.3.1 (ref. 40) foi usado para prever a capacidade das interações RNA-RNA de ocorrer nas regiões identificadas durante a análise SPLASH, usando o modo Exato (-mode E) e nenhuma opção de restrição de sementes (-noSeed). As reatividades SHAPE-MaP foram incluídas na modelagem das interações RNA-RNA (-tShape e -qShape). Os conjuntos de dados permutados foram gerados por embaralhamento aleatório dos parceiros de interação específicos identificados pelo SPLASH e avaliação da interação ΔG energias usando o IntaRNA. O significado da diferença entre as distribuições de probabilidade das energias ΔG associadas às interacções RNA intermoleculares identificadas pelo SPLASH versus os conjuntos de dados permutados foi calculado usando o teste Wilcoxon rank-sum no software R. As previsões da estrutura IntaRNA foram então usadas para aparar as regiões de interação com os nucleotídeos envolvidos no emparelhamento de base. Onde os dados SHAPE-MaP não estavam disponíveis (reortantes PR8 com vírus H3N2), a pré-divulgação de cada filamento de RNA (‘acessibilidade’) foi desabilitada no IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Para validação contra estruturas conhecidas, os dados da estrutura secundária do RNA foram extraídos da base de dados do RNA3Dhub41, com base nas estruturas de microscopia eletrônica criogênica do ribossomo 80S42 (PDB: 6EK0) e do complexo triplo de ribonucleoproteínas U4/U6.U5 de pequena dimensão nuclear43 (EMDB: EMD-2966). As seqüências de RNA de referência foram corrigidas para combinar seqüências de RNA bovino (MDBK) para RNA ribossômico e RNAs nucleares pequenos U4/U6, conforme descrito anteriormente44. Para previsões de estrutura do RNA intramolecular, foi usado o pacote ViennaRNA v.2.0 (ref. 45). O comando RNAfold foi usado para predizer estruturas secundárias de RNA e funções de partição para cada segmento. As reatividades SHAPE-MaP foram incluídas como restrições de pseudo-energia. Uma análise de correlação da janela mediana deslizante de 50 nt entre o ex virio e no virio perfis de reatividade SHAPE-MaP foi usada para determinar a extensão da correlação SHAPE-MaP entre o RNA associado ao T7 e o RNA associado ao vRNP. Verificamos que não existia correlação >150 nt; portanto, definimos a restrição de distância máxima de emparelhamento para previsões de estrutura e função de partição para 150 nt. Para previsões de estrutura intramolecular, definimos os nucleotídeos dentro da região promotora como sendo de cadeia única.

Cultura de células para engenharia reversa de vírus influenza

Células MDCK e células do rim embrionário humano (HEK 293T) foram obtidas de uma coleção existente no Departamento de Microbiologia e Imunologia, Universidade de Melbourne. As células MDCK foram cultivadas no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich) e as células HEK 293T foram cultivadas no DMEM (Thermo Fisher Scientific). Ambos os meios foram suplementados com FCS 10% ativada por calor, 2 mM l-glutamina, 2 mM piruvato de sódio, 24 μg ml-1 gentamicina, 50 μg ml-1 estreptomicina e 50 IU ml-1 penicilina. Coculturas de células MDCK e células HEK 293T para transfecção foram estabelecidas em Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) com 50 μg ml-1 estreptomicina e 50 UI ml-1 penicilina.

Construção de vírus da influenza de engenharia reversa

Grupos de genes individuais dos vírus PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) e Wyo03 (H3N2) foram transcritos e clonados em plasmídeos de pHW200046. Os vírus derivados da genética reversa continham um gene PR8, Udorn, Mem71, PC73 ou Wyo03 PB1 com um gene de tipo selvagem ou modificado NA em um fundo genético composto por seis segmentos do vírus PR8 (PB2, PA, HA, HA, NP, M e NS). O gene NA modificado (Wyo03UdSub) foi derivado de Wyo03 e levou 4 substituições para a seqüência Udorn-NA: nucleotídeos G943A; C938U; U933C; e G923A. Três destas quatro alterações de nucleotídeos foram silenciosas, com a quarta (A534G) resultando numa alteração conservadora de lisina para arginina (K172R). Fragmentos complementares incorporando estas alterações foram gerados por PCR e unidos por outra série de PCR usando iniciadores específicos do segmento contendo locais de restrição BsmBI47; o produto foi clonado no vector de expressão do pHW2000 para resgate do vírus. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela Complementar 3. Os vírus resgatados foram amplificados em ovos de galinha embrionados 10-d. O fluido alantóico infeccioso foi titulado para o conteúdo de vírus pela formação de placas em células MDCK48 e armazenado a -80 °C.

Determinação da cinética de replicação viral dos vírus de engenharia reversa

As características de replicação dos vírus de engenharia reversa foram determinadas pela infecção das células MDCK a um MOI de 0,01. Após 1 h de absorção (a t = 0 h) o inóculo foi removido e as células foram lavadas e incubadas a 37 °C, 5% de CO2 em RPMI 1640 suplementado com 2 mM l-glutamina, 2 mM piruvato de sódio, 24 μg ml-1 gentamicina, 50 μg ml-1 estreptomicina, 50 IU ml-1 penicilina e 1 μg ml-1 de tripsina tratada com TPCK (Worthington Biochemical Corporation). Os sobrenadantes de cultura celular foram coletados em vários pontos de tempo pós-infecção e armazenados a -80 °C para análise. Os títulos virais foram determinados pela formação de placas em monocamadas confluentes de células MDCK.

Nine-plasmid competitiva engenharia reversa de vírus influenza

A engenharia reversa competitiva de vírus influenza foi realizada usando uma versão modificada do sistema genético reverso de oito plasmídeos26 como descrito anteriormente25. Em resumo, plasmídeos codificando o RNA viral PB2, PB1, PA, hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), proteína matriz (M) e proteína não-estrutural (NS) segmentos de RNA viral PR8 foram cotransfectados com plasmídeos codificando o RNA viral neuraminidase (NA) e RNA viral PB1 concorrente de Udorn, Mem71, PC73 ou tipo selvagem ou Wyo03 modificado. Cada plasmídeo (1 µg) foi misturado com o reagente de transfecção FuGENE 6 (Promega) em Opti-MEM e adicionado a uma cocultura de células HEK 293T e MDCK. Seis horas pós-transfecção, o meio foi substituído por Opti-MEM suplementado com 50 μg ml-1 estreptomicina e 50 IU ml-1 penicilina. Vinte e quatro horas depois, a tripsina tratada com TPCK (1 μg ml-1) foi adicionada e o sobrenadante coletado após mais 42 h e armazenado a -80 °C. Para determinar as frequências de incorporação dos genes PB1 concorrentes, os vírus progenitores no sobrenadante da transfecção foram submetidos a um ensaio de placa nas células MDCK. Placas escolhidas aleatoriamente (aproximadamente 36 por experimento) foram colhidas por amostragem através da agarose e ressuspendidas em 0,05% de Triton-X100. A fonte dos segmentos gênicos concorrentes foi identificada por RT-PCR quantitativo específico do gene usando a sonda SensiFast RT-PCR Kit (Bioline) no modelo de uma etapa RT-PCR. Cada 20 μl de reação foi realizada usando 5 μl de suspensão de vírus em placas, 10 μl de 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix, 0.2 μl de transcriptase reversa, 0.4 μl de inibidor Ribosafe RNase, 0.8 μl de cada 10 μM de primer para frente e para trás específico do gênero e 0.08 μl de cada 25 μM de sonda específica do gênero. As seqüências de primer e sonda são dadas na Tabela Suplementar 3. A reacção RT-PCR foi incubada durante 10 min a 45 °C, antes de se proceder à amplificação qPCR, de acordo com as instruções do fabricante. Os valores reportados são dados combinados de 3-8 experimentos de transfecção independentes para cada competição.

Síntese do Relatório

Outras informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.