Abstract
O presente trabalho mostra que é apresentada uma descrição detalhada da ultraestrutura das células secretoras das ilhotas pancreáticas do peixe-gato sul-americano Rhamdia quelen. Evidências são oferecidas para apoiar a alegação de que as grânulos α consistem de uma porção central e uma porção externa de diferentes densidades e solubilidades de elétrons, que as células δ são muito provavelmente morfologicamente alteradas, mas viáveis α-células, e que as grânulos β-grânulos possivelmente possuem uma subestrutura de repetição e podem, portanto, representar uma forma de armazenamento intracelular cristalino de insulina.
1. Introdução
As ilhotas de Langerhans foram descobertas no coelho por Langerhans em 1869. No entanto, foram relatados por Estanislau e Blockmann em teleosts cerca de 20 anos antes e por isso são também, embora com menos frequência, referidos como corpos de Estanislau ou Blockmann. As ilhotas de Langerhans são de origem endodérmica e na maioria dos teleósts são encontrados como pequenos corpos espalhados na porção exócrina do pâncreas .
Os peixes não têm um pâncreas discreto. O tecido exócrino do pâncreas pode ser encontrado espalhado ao longo do tracto intestinal. A estrutura acinar do pâncreas exócrino é muito semelhante à dos mamíferos e compreende células com um citoplasma basofílico muito escuro. Na alimentação activa dos peixes, contêm um grande número de grânulos eosinófilos brilhantes e secretos. Pode-se distinguir a ilhota endócrina pancreática de Langerhans, e o tecido engloba α-células (produzindo peptídeo tipo glucagon), β-células (produzindo insulina), e d-células (produzindo somatostatina) . Em mamíferos e humanos a maioria das descrições microscópicas eletrônicas anteriores de ilhotas pancreáticas humanas adultas têm sido breves e pequenas porções de publicações são dedicadas principalmente a descrições de β – tumores de células ou artigos de pesquisa discutindo a morfologia comparativa das ilhotas de várias espécies .
O pâncreas de peixe não costuma ser uma fonte pronta de tecido para estudo microscópico eletrônico. O pâncreas dos principais peixes é anatomicamente e desenvolvidamente semelhante ao pâncreas dos mamíferos, enquanto que as grandes diferenças são aparentes noutras espécies de peixes. No zebrafish adulto, o pâncreas principal contém várias ilhotas principais rodeadas por tecido exócrino. Uma cauda de ilhotas únicas incrustada em tecido exócrino e gordura estende-se caudalmente ao longo do intestino. Em contraste, as células de tilápia β (outro peixe sensível ao glucose-teleost) residem em ilhotas de Langerhans localizadas ao longo do mesentério que não estão rodeadas por tecido exócrino. Rhamdia quelen é uma espécie teleost e é uma espécie importante para a aquacultura em climas subtropicais. R. quelen é encontrada do sul do México até o centro da Argentina, e a criação desta espécie está se espalhando para o sul do Brasil .
Neste estudo analisamos a ultra-estrutura das ilhotas de Langerhans e descrevemos em detalhes os diferentes tipos de células secretoras no bagre R. quelen.
2. Materiais e Métodos
Quatro R. quelem cultivado duas fêmeas e dois machos ( g; cm) do Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) na região nordeste da Argentina e estocados em tanques de 200 L onde foram aclimatados durante duas semanas antes da necropsia. Os peixes foram criados com água doce filtrada mantida a 25°C com uma taxa de troca de água de 100% por dia. O fotoperíodo foi ajustado para 12 h de escuridão e 12 h de luz. Foram alimentados à mão quatro vezes por dia com dieta comercial (Ganave). Os peixes foram eutanizados com benzocaína (500 ppm) e necropsiados e amostras de gordura que se estende caudalmente ao longo do intestino foram fixadas em formalina tamponada a 10%, embebida em parafina, e corada com hematoxilina e eosina (H&E).
Fragmentos pequenos de tecido foram cortados em blocos de 1 mm e imediatamente fixados em glutaraldeído tamponado com fosfato (pH 6.9 a 4°C), lavados em solução de Millonig e pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1%; os blocos de tecido foram então desidratados em uma série graduada de etanol-acetona, imersos em óxido de propileno e embutidos em Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Suíça). Os cortes finos foram cortados com um ultramicrotomo LKB e corados duplamente com acetato de uranila e citrato de chumbo antes do exame em um microscópio eletrônico Jeol JEM-8T (Jeol, Tokyo, Japão).
3. Resultados
3.1. Microscopia leve
R. quelen têm o pâncreas espalhado pelo tecido adiposo ao redor do ducto biliar comum; isto se encontra dentro de uma região aproximadamente triangular delineada superiormente pelo estômago, anteriormente pelo fígado, e inferiormente pelo baço e vesícula biliar. Cada ilhota de Langerhans é composta por tecido relativamente puro de ilhota rodeado por pâncreas exócrino (Figura 1). Não foram observadas diferenças entre machos e fêmeas.
3.2. Microscopia eletrônica
As células β, que normalmente ocupam o interior das ilhotas, eram comum, mas nem sempre, separadas do pâncreas exócrino pelas células periféricas α-células (Figura 2). O aspecto ultra-estrutural das células de β foi idêntico nas amostras obtidas dos quatro peixes. As grânulos característicos de β estavam contidas em sacos de membrana lisa e eram variáveis em tamanho e forma. Os cristais rectangulares, quadrados, hexagonais e irregulares e poligonais eram visíveis. As formas redondas estavam presentes mas com menor frequência (Figuras 2 a 5). Cada grânulo consistia de uma ou várias formas cristalinas ou não estruturadas de tamanho e forma variáveis. A escolha do fixador não parecia influenciar a estrutura interna dos grânulos de β. Dentro dos limites da membrana envolvente, a área periférica aos cristais parecia vazia ou continha um fino precipitado floculento, independentemente do fixador utilizado. Em ampliações maiores, uma subestrutura de repetição era por vezes visível nesses cristais devidamente orientada em relação ao plano de secção (Figuras 6 e 7). As numerosas mitocôndrias estavam dispersas por toda a célula e apareciam como estruturas filamentosas arredondadas ou plump. Eram maiores e mais numerosas do que as da célula β, mas geralmente menores do que as das células acinares pancreáticas. As numerosas cristas mitocondriais eram, na sua maioria, orientadas transversalmente, e os grânulos mitocondriais estavam presentes, mas não proeminentes. As cisternas do retículo endoplasmático granular eram geralmente curtas ou vesiculares (Figuras 2 a 4). O retículo endoplasmático granular e os ribossomos livres não eram uma característica tão proeminente das células β como no acinar ou nas células β. As células β com poucos grânulos secretos normalmente eram mais ricamente dotadas de ribossomos e retículo endoplasmático granular, que era então mais frequentemente cisternal em configuração (Figura 5).
O complexo de Golgi foi mais proeminente após a fixação dos aldeídos e as estruturas componentes foram mais dilatadas (Figura 2). Após a utilização destes fixadores, material amorfo denso era ocasionalmente visível dentro das vesículas de Golgi e pode representar grânulos imaturos ou precursores dos grânulos-secretos de β. Os núcleos celulares de β eram geralmente esféricos e relativamente lisos no contorno. A membrana celular das células de ilhotas adjacentes estava em posição próxima, embora não frequentemente unida por desmosomas. Na junção de três ou mais células, as membranas limitantes eram frequentemente convolutas, com interdigitações tortuosas das células (Figuras 2 e 9). As inclusões citoplasmáticas multiviculares que se assemelham ao ceróide eram conspícuas na maioria das células β (Figuras 2, 7, 9 e 8). O aparecimento e a freqüência dessas inclusões não foram sensivelmente afetados pelo uso primário de ácido ósmico ou aldeído como fixador, e não houve relação aparente entre a presença desses grânulos e a evidência morfológica da atividade fisiológica pelas células. A ultraestrutura das células α foi a mesma em todas as quatro amostras de tecido. O tamanho e forma destas células e dos seus núcleos não foram significativamente diferentes dos das células normais do β (Figuras 2 e 7). Embora se tenha encontrado ocasionalmente uma célula α com um núcleo de forma irregular ou indentada, isto não ocorreu com frequência suficiente para servir como um critério diferenciador útil. Os grânulos citoplasmáticos das células α foram preservados por fixação primária de ósmio como corpos densos, esféricos, de tamanho variável e foram contidos dentro de sacos de membrana lisa e frouxamente encaixados (Figuras 7 e 9). Eram maiores que os grânulos de β, mas consideravelmente menores que os grânulos de zymogen das células acinares (Figura 2). As mitocôndrias esbeltas e alongadas eram em número moderado e menores que as das células β e possuíam cristais que geralmente eram orientadas transversalmente. O retículo endoplasmático granular era frequentemente cisternal em configuração e mais abundante do que nas células de β (Figura 9). O complexo de Golgi, quando visível, era de proporções moderadas. Materiais amorfos densos dentro das vesículas de Golgi e cisterna, presumivelmente os precursores dos grânulos secretores, eram mais comuns nas células α do que nas células β (Figura 10). Os corpos ceróides, embora frequentemente visíveis, eram menos numerosos do que nas células β (Figuras 2 e 3). Os sacos em que estão situados os grânulos do α pareciam, portanto, estar completamente cheios e concluiu-se que os grânulos consistem num núcleo interior redondo e denso e um manto exterior menos denso de electrões, ausente após a fixação do ósmio (Figuras 3 e 9) e, portanto, talvez mais solúvel. Nenhuma subestrutura consistente era visível dentro das porções internas ou periféricas dos grânulos do α. Em nenhum momento foram vistas células que pudessem ser interpretadas como formas de transição entre as células α e as células β. As grânulos α, incluindo as porções externas e internas mais densas, eram comparáveis em tamanho total ao “α -grânulos”. Além disso, estão presentes células intermediárias que continham grânulos de ambos os tipos, o que sugere que as células δ foram de fato modificadas as células α (Figura 10). As células δ foram visualizadas, embora quase sempre localizadas entre as células α, e foram identificadas e distinguidas ultra-estruturalmente das células α, com base na menor densidade de elétrons e no maior tamanho total de seus grânulos secretos. Além disso, estão presentes células intermediárias que continham grânulos de ambos os tipos sugerindo que as células δ foram de fato modificadas α-cells (Figura 11).
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Embora existisse uma relação inversa entre o número de grânulos secretores e a proeminência do complexo de Golgi e o retículo endoplasmático granular, não foi observado nenhum padrão de liberação de α- ou β-grânulos. Uma fina membrana basal e quantidades variáveis de tecido conjuntivo normalmente separavam as ilhotas pancreáticas das células acinares adjacentes (Figura 2). Ocasionalmente, entretanto, nenhuma membrana subterrânea interveio entre as ilhotas e as células acinares, as quais foram separadas apenas pelo estreito espaço intersticial. As células endoteliais capilares fenestradas foram sempre separadas delas pelo menos pela membrana do porão capilar (Figura 9). Outros elementos de suporte, incluindo componentes de colágeno e tecido elástico, também estavam por vezes presentes. Não foram observadas diferenças entre machos e fêmeas.
4. Discussão
Pesca β-células são facilmente distinguidas das α-células pela morfologia dos grânulos secretores. A presença frequente de subunidades angulares e a aparente repetição da subestrutura sugerem uma natureza cristalina para os grânulos de β. Tentativas de resolver e medir as dimensões de uma malha de cristal ainda não foram bem sucedidas. Quando os grânulos secretos foram visualizados nas proximidades do complexo Golgi, as subunidades cristalinas não foram normalmente observadas. É tentador especular, portanto, que os grânulos não cristalinos ou o material amorfo dentro do complexo de Golgi representam uma forma química ou física de insulina ou complexo proteico de insulina diferente das subunidades cristalinas do grânulo. Não se sabe se estas diferentes formas morfológicas dentro do complexo β-grânulos têm solubilidades diferentes e talvez padrões diferentes de orados de liberação em resposta à demanda fisiológica. Grânulos secretos não foram observados nas cisternas ou vesículas do retículo endoplasmático granular. Supõe-se que, como com outras células secretoras de proteínas, o complexo Golgi funciona para concentrar ou “embalar” o produto sintetizado no retículo endoplásmico granular. Seguir-se-ia logicamente que os sacos de membrana lisa nos quais os grânulos secretores estão contidos são derivados das membranas de Golgi e não do retículo endoplasmático granular.
As células α com seus grânulos secretores grandes, arredondados e densos são bastante semelhantes às células α de outras espécies. Embora os grânulos das células α variem muito em dimensão, a maioria das células parece possuir um sortimento de grânulos de diferentes tamanhos, excluindo assim uma subclassificação deste tipo de célula como foi sugerido para outras espécies . Neste momento, não foram publicados dados fisiológicos que sustentem a existência da “δ-célula” na ilhota pancreática do peixe. Os vários protagonistas apoiaram a existência das células δ com dados baseados em exames microscópicos de prata caprichosa, ácido fosfotúngstico-hematoxilina, e outras manchas de grânulos ou estudos microscópicos electrónicos de tecidos mal conservados. As micrografias aqui apresentadas apoiam a opinião considerada pela Bloom em 1931 e posteriormente por Gomori em 1941 de que δ-células podem representar células modificadas α-células.
A transição da grânula típica α, com porções internas densas e externas menos densas, para uma grânula δ- de aproximadamente o mesmo tamanho, com densidade uniforme mas decrescente, é frequentemente acompanhada por uma perda gradual da integridade morfológica ou intensidade de coloração das mitocôndrias, complexo de Golgi e componentes membranosos do retículo endoplasmático granular. Os núcleos intactos e viáveis, bem como a persistência de pequenos números de ribossomos livres e corpos ceróides, sugerem que as chamadas células δ são viáveis mesmo no presumível estágio final desta transição, ou seja, onde os próprios grânulos secretos não são mais visíveis e todas as organelas citoplásmicas que não sejam grânulos ceróides e ribossomos estão ausentes. Na ausência de dados fisiológicos atribuindo uma função às células δ e na ausência de evidências morfológicas mais convincentes para um tipo celular separado, espera-se que a apresentação aqui de uma provável transição das células α para δ seja aceite como a explicação mais provável da terceira célula granular de Bloom em humanos. O significado destas células viáveis mas alteradas do α-células não é conhecido. Embora as células α- e β-cells, isoladamente ou em pequenos grupos, possam ser vistas dentro de acinídeos e dutos, em nenhum momento em qualquer das quatro amostras pancreáticas estudadas foram vistas quaisquer formas intermediárias entre acinídeos e ilhotas ou células de ilhotas, como foi sugerido por Nakamura e Yokote (4).
Conflito de interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.
Conhecimento
L. A. Romano recebeu bolsas de pesquisa de produtividade do Conselho Brasileiro de Pesquisa, CNPq (Processo nº PQ 301002/2012-6).