Aristóteles ensinou Alexandre (356-323 a.c.e.) antes do príncipe herdar o trono da Macedônia em 336 a.c.e. e começou a estender o império que seu pai havia conquistado. Mais tarde, o jardim do Liceu em Atenas veio a conter plantas contribuídas por seguidores dos exércitos de Alexandre. Theophrastus baseou muitas de suas descrições de plantas em relatos que ele obteve de viajantes que tinham visitado regiões distantes do império de Alexander. A biblioteca em Alexandria, que Dioscorides provavelmente usou, abriu durante o reinado do general de Alexandre Ptolomeu I Soter (ca. 367 b.c.e.-ca. 283 b.c.e.). Ptolomeu eu era um amigo íntimo de Alexandre e talvez tenha sido um colega de ensino de Aristóteles. Ele se tornou governante do Egito em 323 a.c.e. após a morte de Alexandre. O trabalho real de planejamento e supervisão da biblioteca foi delegado a Demétrio de Faleron (ca. 350-ca. 280 a.c.e.), um estudante do Liceu de Theophrastus.

Alexander governou a Macedônia como regente de 340 a.c.e., enquanto seu pai, Filipe II, liderou um grande exército macedônio que invadiu a Trácia, o país limítrofe da Macedônia no leste. Mais tarde, Alexandre discutiu com Filipe e deixou a Macedónia, mas em 336 a.c.e. Filipe foi assassinado e Alexandre, com 20 anos de idade, tornou-se Alexandre III da Macedónia, mais tarde chamado Alexandre o Grande. Quando a notícia da morte de Filipe se espalhou, as pessoas nos países conquistados pelos macedônios viram uma chance de conquistar sua liberdade, e Alexandre teve que agir. Ele começou executando todos os seus oponentes dentro da Macedônia, depois restaurou o domínio macedônio na Grécia, Trácia e Ilíria.

Leaving an experienced general Antipater (ca. 398-319 b.c.e.) para manter a ordem em casa, em 334 b.c.e. Alexandre liderou uma grande força na Ásia Menor como o primeiro estágio de sua expansão imperial. Os macedônios derrotaram um grande exército persa, asseguraram a costa da Ásia Menor, e em 333 a.c.e. eles lutaram e derrotaram outro exército persa, este liderado pelo rei persa Dario III. As forças de Alexandre então lutaram em direção ao sul através da Síria e da Fenícia. Na primavera de 331 a.c.e., os macedónios entraram no Egipto. Após alguns meses regressaram a Tiro, onde receberam reforços da Europa e se dirigiram para o leste. Derrotaram os persas mais uma vez em Gaugemala, a leste do rio Tigre, ocuparam a Babilônia e depois capturaram Susa e a capital persa, Persépolis, e Alexandre foi proclamado rei da Ásia. Os macedónios retomaram então a sua perseguição a Dario, que encontraram a morrer devido a ferimentos infligidos por um dos seus próprios nobres – que mais tarde foi capturado pelos macedónios e punido pelas ordens de Alexandre. Pressionando para o leste na Ásia central, eles chegaram às montanhas Tian Shan na China ocidental, onde uma estatueta de um soldado grego foi encontrada em um local de enterro.

Em 326 a.c.e. Alexandre convidou os chefes do que é agora o norte do Paquistão a submeterem-se ao seu governo. Alguns concordaram, mas outros se opuseram aos macedônios e só foram superados após intensos combates nos quais Alexandre foi ferido. Os soldados macedónios, que ansiavam por ver as suas casas e famílias, opuseram-se ao plano de Alexandre para pressionar mais longe na Índia e persuadiram-no a voltar para trás. Eles chegaram à Babilónia, onde Alexandre morreu a 11 de Junho de 323 a.C., no palácio de Nabucodonosor II. Os historiadores são incertos sobre a causa de sua morte, mas é mais provável que tenha sido por doença. Em mais um mês, Alexandre teria 33 anos de idade. Como mostra o mapa seguinte, no seu auge, o seu império estendeu-se desde a Macedónia, a oeste, até ao Vale do Indo, a leste, e desde as margens sul dos Mares Negro e Cáspio até ao Egipto. O império começou a desintegrar-se dentro de poucos anos após a morte de Alexandre, quebrando em muitos reinos independentes.

Alexander tinha sido um estudante de Aristóteles, e embora a educação do jovem fosse interrompida ele era altamente inteligente e Aristóteles tinha exercido uma forte influência no seu desenvolvimento. Aristóteles encorajou todos os seus alunos a observar e investigar o mundo natural, e Alexandre estava muito interessado em plantas e animais. Um grande séquito de estudiosos o acompanhou enquanto ele liderava seus exércitos. Eles mediram distâncias, prepararam mapas, estudaram religiões desconhecidas, e também a flora e a fauna. Quando se deparavam com espécies vegetais ou animais desconhecidas, Alexandre enviava espécimes de volta à Europa, muitos deles para o Liceu de Atenas, para a atenção do próprio Aristóteles. Ele recolhia as informações que podia sobre os tratamentos herbais locais e praticava medicina, tratando pessoalmente alguns dos ferimentos e doenças que afligiam seus soldados.

Em 332 a.c.e. Alexandre fundou a cidade de Alexandria, no local de Rhakotis, um porto de pesca egípcio. Ele pretendia que a cidade fizesse a ponte entre as culturas da Grécia e do Egito, mas ele permaneceu lá por apenas alguns meses após o início da construção, e ele nunca mais voltou. Após a morte de Alexandre, Ptolomeu consegui que seu corpo fosse trazido para a cidade. A biblioteca de Alexandria foi construída como uma réplica do Liceu, com um passeio com colunatas e jardins. Havia teatros de conferências, salas de leitura e uma sala de jantar comunitária, e a biblioteca estava localizada ao lado e a serviço do Museu, que era um templo usado como instituição acadêmica – e a origem da palavra museu. Os gerentes da biblioteca foram instruídos para coletar todas as informações do mundo. Representantes da biblioteca assistiram a feiras de livros em Atenas e Rodes, e sempre que um navio chegava ao porto, os livros que transportava eram apreendidos e copiados, a biblioteca retendo os originais e devolvendo as cópias ao comandante do navio. Esta é a biblioteca onde Pedanius Dioscorides pode ter estudado. Grande parte da biblioteca foi acidentalmente incendiada em 48 a.c.e. durante uma guerra civil, e embora um ramo da biblioteca, conhecido como a biblioteca filha, continuou a funcionar ao sul da cidade, ela também foi destruída em 391 a.c. quando o imperador romano Teodósio I (347-395) ordenou a destruição de todos os templos pagãos.