Abstract
Background. Amiloidose é a precipitação extracelular de material hialino eosinofílico de origem própria com características especiais de coloração e ultraestrutura fibrilar. A amiloidose macular é limitada à pele, e vários fatores têm sido propostos para a sua patogênese. A detecção do DNA do vírus Epstein-Barr (EBV) nesta lesão sugere que este vírus pode desempenhar um papel na patogênese desta doença. Objetivo. A detecção do ADN EBV foi feita em 30 amostras de pele com diagnóstico de amiloidose macular e 31 amostras de pele saudável na margem de nevos melanocíticos removidos através da PCR. Resultados. Em pacientes positivos para o gene da betaglobina em PCR, o gene BLLF1 do vírus EBV foi positivo em 23 pacientes (8 pacientes no caso e 15 pacientes no grupo controle). Não houve diferença significativa na presença do DNA do EBV entre os grupos amiloidose macular (3,8%) e controle (23,8%) (). Conclusão. Os achados deste estudo mostraram que o EBV não está envolvido na patogênese da amiloidose macular.
1. Introdução
Amyloidose é a deposição extracelular de um grupo de proteínas fibrosas. Há uma variedade de abordagens para classificação da amiloidose, mas o método mais simples é a divisão em tipos sistêmicos e específicos de órgãos (localizados). A pele é um tecido envolvido em ambos os tipos. A amiloidose localizada cutânea é de dois tipos: (i) queratínica, que pode ser primária ou secundária, e (ii) nodular. O tipo secundário é secundário a outras lesões cutâneas, como tumores cutâneos, distúrbios cutâneos inflamatórios e fototerapia. Dois tipos de amiloidose queratósica foram identificados: amiloidose macular e amiloidose de líquen, sendo esta última mais comum. Na amiloidose queratósica, as deposições de queratina proveniente de queratinócitos basais são principalmente positivas para CK5. O tipo queratósico é observado principalmente no Sudeste Asiático, América do Sul e China. Tem formas familiares (10%) e esporádicas, sendo esta última mais comum nas mulheres. Os locais mais comuns de envolvimento são as costas (área interescapular) e extremidades (canelas e braços), embora também tenham sido descritos na face, tronco e coxas . As lesões da amiloidose macular geralmente aparecem na forma de manchas hiperpigmentadas com margens indefinidas compostas por máculas marrom acinzentadas, freqüentemente com aparência reticulada ou ondulada (Figura 1). Coceira é um sintoma comum antes do início da amiloidose .
A patogénese desta desordem não está totalmente elucidada, excepto pelo facto da queratina depositada ser derivada de queratinócitos . Dois mecanismos patogênicos foram propostos, incluindo a teoria apoptótica (fibrilar) e a teoria secretora . Com base na teoria apoptótica, a degeneração dos queratinócitos danificados na camada basal é seguida pela conversão desses corpos colóides por histiócitos dérmicos e fibroblastos em amilóide na derme papilar (Figura 2). De acordo com a teoria secretora, depósitos de amilóide derivados de queratinócitos basais degenerados espalham-se na derme papilar através da lâmina densa danificada. Existem vários fatores etiológicos implicados na patogênese da amiloidose macular: fatores raciais, predisposição genética, fatores ambientais, sexo (feminino), hormônios femininos, exposição à luz solar, fricção (abrasão a longo prazo), atopia, auto-imunidade (baseada na associação com lúpus eritematoso sistêmico, dermatomiosite, esclerose sistêmica, sarcoidose e nefropatia IgA), e infecção com EBV. A EBV, cuja presença tem sido relatada na epiderme da amiloidose macular, é provável que atue como um fator que contribui para a degeneração dos queratinócitos .
O papel do EBV na etiopatogenia da amiloidose cutânea primária foi avaliado em apenas dois estudos prévios, incluindo um único relato de caso e uma série de casos de 27 pacientes da China. Considerando a escassez de estudos sobre a associação entre EBV e amiloidose macular, propusemo-nos a realizar um estudo a este respeito no Irão. Talvez agentes antivirais possam ser usados no futuro para tratamento desta doença em caso de associação com EBV.
2. Materiais e Métodos
Neste estudo caso-controle, 38 amostras de amiloidose macular e 38 amostras de pele saudável ao redor de nevos melanocíticos excisados de pacientes com idade e sexo combinados, sem amiloidose macular, foram inscritos no exame clínico com base em uma amostragem não orientada a objetivos. Os critérios de inclusão incluíram blocos de parafina com tecido suficiente nos arquivos do Departamento de Patologia do Hospital Imam Reza em Mashhad diagnosticados com amiloidose macular com base no relatório de patologia e na apresentação clínica. Os critérios de exclusão incluíram blocos com dados imperfeitos nos registros e amostras insuficientes para PCR.
No grupo de casos, a deposição amilóide foi confirmada por microscopia óptica e coloração vermelha do Congo. Na etapa seguinte, seis 5 seções μm foram preparadas a partir de cada um dos blocos nos grupos caso e controle em condições estéreis usando lâmina estéril e foram colocadas em tubos Eppendorf estéreis.
2.1. Deparaffinização
Xilol/etanol foi utilizado para desparafinizar os tecidos parafinizados. Um mL de xilol foi adicionado a microtubos contendo cortes de tecido e incubado em temperatura ambiente por meia hora com agitação constante. No passo seguinte, os microtubos foram centrifugados em 13.000 rpm por 10 minutos, e seu sobrenadante foi descartado. Estes dois passos foram repetidos uma vez. Quinhentos μL de etanol 100% foram adicionados ao precipitado e centrifugados por 10 m em 13.000 rpm após várias inversões de microtubos, e o sobrenadante foi então removido. Esta etapa foi repetida novamente. Finalmente, o precipitado resultante foi colocado em temperatura ambiente para evaporar completamente o etanol, mas não o precipitado.
2,2. A extração de DNA
A extração de DNA foi feita utilizando o kit BIO BASIC INC (Canadá) com o lote número 8401-140116. Lysis buffer-T foi usado para extração. No passo seguinte, 100 μL tampão de extracção e 10 μL proteinase K foram adicionados a cada microtubo e foram misturados. As amostras de tecido foram adicionadas à mistura e incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, as amostras foram incubadas a 95°C durante 3 minutos para inactivar a proteinase K. 100 μL Tampão universal NST foi adicionado aos tubos e invertido 10 vezes. A mistura obtida foi utilizada para PCR.
2.3. PCR
Neste estudo, a PCR foi utilizada para detectar a presença do genoma EBV na amiloidose macular. Após a extracção de ADN a partir de blocos parafinados, a qualidade do ADN extraído a partir de tecidos em parafina foi determinada utilizando iniciadores do gene da beta-globina. Os primers dos genes GH20 e PC04 beta-globina utilizados neste estudo amplificaram um fragmento de 260 bp. A sequência destes primers foi a seguinte: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′. As amostras que produziram o fragmento de 260 bp utilizando os iniciadores desejados foram consideradas favoráveis à amplificação do gene BLLF1 do vírus EBV.
A presença da sequência EBV nas amostras de ADN extraídas foi testada utilizando o Cinna Gen kit com o número de lote 935701 (Sina Clon, Irão). Este kit foi concebido para determinar a qualidade do ADN EBV em amostras infectadas utilizando a PCR. O reagente utilizado para a mistura foi 1x PCR optimizado como mistura de Taq DNA polimerase recombinante, tampão PCR, MgCl2, dNTPs e primers. A região altamente específica e repetitiva do gene BLLF1 que codifica o gp 350/220 é amplificada por iniciadores. Eles podem detectar pelo menos 30 cópias de EBV. A presença de fragmentos de 239 bp ou 256 bp indica um resultado positivo no teste.
A análise de dados foi realizada usando o software SPSS 11.5. Gráficos e tabelas estatísticas foram usados para descrever dados e testes qui-quadrados e independentes foram usados para comparar o EBV em amostras saudáveis e de pacientes. Em todos os testes, o nível de significância de 0,05 foi considerado.
3. Resultados
Cinco por cento dos pacientes eram homens (19/38) e 50% eram mulheres (19/38). Três pacientes estavam na faixa etária abaixo de 20 anos (7,9%), 5 pacientes 20-30 anos (13,2%), 10 pacientes 30-40 anos (26,3%), 13 pacientes 40-50 anos (34,2%), 4 pacientes 50-60 anos (10,5%), e 3 pacientes acima de 60 anos (7,9%). As idades mínima e máxima foram de 19 e 76 anos, respectivamente. Houve 27 casos de infecção no tronco (71,1%) e 11 casos nas extremidades (28,9%). O grupo estudo e controle foram pareados para idade () e sexo ().
PCR foi realizado para o gene beta-globina em 76 amostras (38 casos e 38 controles), que foi positivo em 61 amostras (30 amostras no grupo caso e 31 no controle) e negativo em 15 amostras (8 amostras no caso e 7 no controle) (Figura 3).
Em 61 amostras positivas para o gene da beta-globina em PCR, o gene BLLF1 do EBV foi positivo em 23 casos (8 casos no grupo de estudo e 15 casos no grupo controle) e negativo em 38 casos (22 casos no grupo de estudo e 16 casos no grupo controle) (Figura 4).
PCR do gene BLLF1 do EBV foi 26,7% positivo no grupo de estudo e 48,4% positivo no grupo controle. Os resultados do teste qui-quadrado não mostraram correlação entre EBV e amiloidose macular () (Tabela 1).
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4. Discussão
Amyloidose é conhecida como deposição extracelular de material hialino eosinofílico de origem própria com coloração específica e características ultra-estruturais. Esta desordem pode ocorrer no fundo de doenças sistêmicas ou pode estar limitada à pele. A amiloidose macular está limitada à pele. A EBV pode estimular a secreção de material amilóide por queratinócitos ou pode ser um estímulo para a degeneração de queratinócitos e conversão de filamentos degenerados de queratinócitos em amilóide . Estudos recentes indicaram o papel das células epiteliais na reprodução contínua do EBV. Os receptores de superfície das células EBV encontrados em epitélio escamoso menos diferenciado sugerem a infecção directa dos queratinócitos epidérmicos. A infecção pode ocorrer em camadas germinativas; no entanto, a replicação do vírus só é viável através da maturação e diferenciação das células. A expressão da citocerceratina nos queratinócitos humanos é alterada in vitro após a infecção com EBV, resultando na sua conversão em fibroblastos. Os fibroblastos podem fagocitar os agregados de queratina e convertê-los em amilóide .
Drago et al. mostraram esta correlação na Itália em 1996. A paciente era uma mulher de 30 anos de idade com dez anos de história de pápulas e máculas marrons com prurido no peito e nas costas com sintomas de síndrome de fadiga crônica. Eles puderam mostrar o genoma EBV em lesões epidérmicas usando a técnica de hibridização in situ. O genoma EBV foi mostrado principalmente em células epidérmicas basais, bem como em células de camadas mais altas, especialmente no citoplasma. Os testes sorológicos para EBV também foram positivos no paciente. A terapia antivirais com aciclovir e interferon alfa melhorou as lesões cutâneas e os sintomas gerais no paciente. Outro estudo foi conduzido por Chang et al. sobre tecido cutâneo de 27 pacientes com diagnóstico de líquen e amiloidose macular em Taiwan, em 1997. O método de hibridização in situ indicou DNA EBV em lesões de 11 pacientes (40,7%), enquanto o grupo controle (incluindo três pacientes com amiloidose cutânea secundária, dois pacientes com amiloidose sistêmica primária e quatro pacientes com líquen simplex crônico) não apresentava DNA EBV .
De acordo com este estudo, não houve correlação entre EBV e amiloidose macular (). O DNA EBV estava presente em 8 pacientes com amiloidose macular e 15 controles em nosso estudo. A diferença na taxa de detecção de DNA EBV entre pacientes com amiloidose macular e controles neste estudo com os estudos mencionados pode ser devida aos seguintes motivos:(1)Falta de associação entre amiloidose macular e infecção por EBV: há alguns estudos que apresentam evidências insuficientes para uma correlação definitiva entre EBV e amiloidose macular, portanto, com base nos resultados do nosso estudo, podemos chegar a esta conclusão.(2)Metodologia (PCR versus hibridação in situ): utilizamos um método sensível para detecção de DNA EBV com controles positivos e negativos. Com base nos estudos anteriores, a PCR é tão sensível como a hibridação in situ . No entanto, como não utilizámos a hibridação in situ, não conseguimos localizar a célula infectada exacta com EBV nos nossos controlos, que podem ser as células B circulantes da pele em vez dos queratinócitos. Como usamos controles positivos e negativos em nosso kit PCR para EBV, os casos positivos em nosso grupo controle não puderam ser falsos positivos.(3)Controles: os controles em nosso estudo foram a pele saudável ao redor dos nevos melanocíticos, mas os controles no estudo Chang foram outros distúrbios cutâneos.(4)Tipo de amiloidose cutânea: em nosso estudo, todos os pacientes tinham amiloidose macular, mas em ambos os estudos anteriores a maioria dos pacientes eram de líquen amiloidose.
5. Conclusão
De acordo com os resultados deste estudo, não houve correlação entre EBV e amiloidose macular. Recomendamos o uso de tecido fresco ou punção de biópsia rapidamente congelada, bem como o estudo serológico simultâneo de pacientes para anticorpos anti-EBV para obter resultados mais precisos para o estudo comparativo do DNA EBV na amiloidose macular. A PCR in situ também pode ser usada para localizar as células positivas de ADN EBV nas amostras. Outros genes podem ser usados para detectar EBV no tecido, uma vez que algumas amostras de EBV são mutantes para o gene BLLF1 usado neste estudo .
Além disso, recomendamos a realização de um estudo comparativo sobre a detecção do EBV na pele envolvida e não envolvida dos pacientes com amiloidose macular.
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores expressam seu profundo agradecimento ao deputado de pesquisa do MUMS pelo apoio financeiro e aprovação da proposta de pesquisa (nº 911283) relacionada à tese de Narges Nazeri. É reconhecido o apoio financeiro do deputado de pesquisa da Universidade de Ciências Médicas Mashhad.