I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Reacção enzimática (a imagem abrirá numa nova janela)

Chymotrypsin é uma endopeptidase serina produzida pelas células acinares do pâncreas. A quimotripsina torna-se activada após a proteólise do quimotripsinogénio pela tripsina. Enquanto a tripsina hidrolisa a lisina e a arginina, a quimotripsina cliva seletivamente as ligações peptídeas formadas por resíduos aromáticos (tirosina, fenilalanina e triptofano) (Hedstrom et al. 1992). Duas formas predominantes de quimotripsina, A e B, são encontradas em quantidades iguais no pâncreas bovino. São proteínas muito semelhantes (80% idênticas), mas têm características proteolíticas significativamente diferentes (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, e Gráf et al. 2004). As informações abaixo referem-se principalmente à forma A de quimotripsinogênio e quimotripsina.

História:

No início do século XIX, Vernon propôs que as preparações pancreáticas poderiam dar origem a um ativador intrínseco de suas próprias enzimas (Vernon 1901). Os experimentos de coagulação do leite de Vernon determinaram que havia pelo menos duas enzimas presentes e que uma era mais estável que a outra (Vernon 1902). Entretanto, esta idéia não foi amplamente aceita até 1934, quando Kunitz e Northrop confirmaram a presença de uma enzima além da tripsina, nomeando-a quimotripsina. Eles foram capazes de cristalizar a quimotripsina, assim como o precursor inativo, chymotrypsinogen (Kunitz e Northrop 1934). Em 1938, Kunitz isolou diferentes formas activas de quimotripsina, designando-as como alfa, beta, e gama (Kunitz 1938).

No início dos anos 40, Fruton e Bergmann estudaram a especificidade da quimotripsina, relatando vários novos substratos (Fruton e Bergmann 1942). Jacobsen logo identificou formas adicionais de quimotripsina, designando-as como delta e pi (Jacobsen 1947). Em 1948, Schwert ainda caracterizou os pesos moleculares da quimotripsina e do quimotripsinogênio.

Em 1954, a primeira evidência para o mecanismo de três etapas da quimotripsina hidrolisando substratos de amida e éster foi relatada por Hartley e Kilby, que colocaram a hipótese da presença de uma enzima intermediária acilo, o que mais tarde se provou ser verdade (Henderson 1970). Em 1955, Laskowski obteve um segundo quimotripsinogênio cristalino, nomeando-o quimotripsinogênio B. Em 1964 Hartley determinou a seqüência de aminoácidos da quimotripsina A, que foi posteriormente refinada por Meloun et al. em 1966. Em 1968, Smillie et al. determinaram a seqüência de aminoácidos da quimotripsina B, que revelou 80% de identidade da seqüência com a quimotripsina A. Durante as décadas de 1970 e 1980 foram feitas pesquisas para entender melhor o mecanismo de ação e identificar as diferenças nas seqüências de aminoácidos entre a tripsina e a quimotripsina (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth e Polgár 1983, e Gráf et al. 1988).

Nos anos 90, a quimotripsina foi purificada a partir de outras fontes, incluindo o bacalhau do Atlântico (Ásgeirsson e Bjarnason 1991), e o camelo (Al-Ajlan e Bailey 1997). O trabalho também começou na investigação de inibidores (Baek et al. 1990), e Frigerio et al. elucidaram a estrutura cristalina da quimotripsina bovina a uma resolução de 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Recent research has investigated the folding and denaturation of chymotrypsin over a range of concentrations (Ghaouar et al. 2010), chymotrypsin’s interaction with nanoparticle substrates (You et al. 2006, e Jordan et al. 2009), e aumentando a estabilidade da quimotripsina através da conjugação com moléculas de PEG (Castellanos et al. 2005, e Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Especificidade:

A quimotripsina é activada através da clivagem da ligação entre arginina e isoleucina (R15 e I16) pela tripsina, causando modificações estruturais e formação do local de ligação do substrato (Sears 2010). A quimotripsina difere da tripsina porque a tripsina cliva peptídeos nos resíduos de arginina e lisina, enquanto a quimotripsina prefere grandes resíduos hidrofóbicos (Hedstrom et al. 1992). A quimotripsina catalisa preferencialmente a hidrólise de ligações peptídeas envolvendo isómeros L de tirosina, fenilalanina, e triptofano. Também atua prontamente sobre amidas e ésteres de aminoácidos suscetíveis. A especificidade da quimotripsina para grandes resíduos hidrofóbicos pode ser explicada por uma ligação hidrofóbica S1 formada por resíduos 189 até 195, 214 até 220, e 225 até 228 (Cohen et al. 1981).

Embora a estrutura da tripsina e do local de quimotripsina S1 mostre apenas uma diferença (na posição 189), a mutagênese local da tripsina e da quimotripsina não conseguiu intercambiar as especificidades, sugerindo que o mecanismo pelo qual a tripsina e a quimotripsina alcançam a catálise específica do substrato não é totalmente compreendido (Steitz et al. 1969, e Gráf et al. 1988).

Molecular Characteristics:

Chymotrypsin A and B share 80% sequence identity (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, e Gráf et al. 2004). Os aminoácidos da tríade catalítica (H57, D102 e S195) são altamente conservados nas sequências das peptídeas da família S1 (Gráf et al. 2004). A serina na posição 214 também é altamente conservada na família e foi proposta como o quarto membro da tríade catalítica (Ohara et al. 1989, e McGrath et al. 1992).

Composição:

Os três aminoácidos residuais da tríade catalítica (H57, D102, e S195) são essenciais para a clivagem da ligação do peptídeo e são estabilizados por ligações de hidrogênio (Sears 2010, e Gráf et al. 2004). G193 e S195 formam o buraco do oxianião e interagem com o grupo carbonilo da ligação do peptídeo escindível, orientando-o para formar o intermediário tetraédrico (Rühlmann et al. 1973, Huber e Bode 1978, e Gráf et al. 2004).

Número de Adesão da Proteína: P00766

CATH Classification (v. 3.3.0):

• Classe: Principalmente Beta
• Arquitectura: Barril Beta
• Topologia: Protease Serine tipo Tripsin

Peso molecular:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

PH ideal: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Ponto isoeléctrico:

• 8.52 (Quimotripsinogénio, Teórico)
• 8,33 (Quimotripsina, Teórico)

Coeficiente de Extinção:

• 51,840 cm-1 M-1 (Teórico)
• E1%,280 = 20.19 (Quimotripsinogênio, Teórico)
• E1%,280 = 20.57 (Quimotripsinogénio, Teórico)

Resíduo do Local Ativo:

• Histidina (H57)
• Aspartato (D102)
• Serina (S195)

Activadores:

• Brometo de cetiltributilamónio (Spreti et al. 2008)

>

• Brometo de dodeciltrimetilamónio (Abuin et al. 2005)
• Brometo de hexadeciltrimetilamónio (Celej et al. 2004)
• Brometo de tetrabutilamónio (Spreti et al. 2001)

Inibidores:

• Hidroximetilpirrolas (Abell e Nabbs 2001)
• Ácidos fluorónicos (Smoum et al. 2003)
• Derivados courmarin (Pochet et al. 2000)
• Aldeídos Peptidyl (Lesner et al. 2009)
• Peptídeos de fontes naturais (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, e Chopin et al. 2000)
• Peptídeos contendo um aminoácido não natural (Legowska et al. 2009, e Wysocka et al. 2008)

Aplicações:

• Análise de sequência
• Síntese de peptídeos
• Mapa de peptídeos
• Impressão digital de peptídeos