Clonagem Molecular é um conjunto de técnicas usadas para inserir DNA recombinante de uma fonte procariótica ou eucariótica em um veículo replicador, como plasmídeos ou vetores virais. A clonagem refere-se a fazer numerosas cópias de um fragmento de DNA de interesse, tal como um gene. Neste vídeo você aprenderá sobre as diferentes etapas da clonagem molecular, como configurar o procedimento e diferentes aplicações desta técnica.

Por pelo menos duas moléculas de DNA importantes são necessárias antes que a clonagem comece. Primeiro, e o mais importante, você precisa do fragmento de DNA que você vai clonar, também conhecido como inserção. Ele pode vir de um procariote, eucariote, um organismo extinto, ou pode ser criado artificialmente no laboratório. Usando a clonagem molecular podemos aprender mais sobre a função de um gene em particular.

Segundo, você precisa de um vetor. Um vector é o DNA plasmídeo usado como ferramenta na biologia molecular para fazer mais cópias ou produzir uma proteína a partir de um determinado gene. Plasmídeos são um exemplo de um vetor, e são circulares, extra cromossômicos, DNA que é replicado por bactérias.

Um plasmídeo normalmente tem um local de clonagem múltipla ou MCS, esta área contém locais de reconhecimento para diferentes endonucleases de restrição também conhecidas como enzimas de restrição. Diferentes inserções podem ser incorporadas no plasmídeo por uma técnica chamada ligadura. O vector plasmídico também contém uma origem de replicação, o que permite a sua replicação em bactérias. Além disso, o plasmídeo tem um gene antibiótico. Se as bactérias incorporarem o plasmídeo, ele sobreviverá em meios que contenham o antibiótico. Isto permite a seleção de bactérias que foram transformadas com sucesso.

A inserção e o vetor são clonados em um organismo de célula hospedeira, o mais comum utilizado na clonagem molecular é a E. coli. A E. coli cresce rapidamente, está amplamente disponível e tem numerosos vetores de clonagem diferentes produzidos comercialmente. Os eucariotas, como as leveduras, também podem ser utilizados como organismos hospedeiros de vetores.

O primeiro passo do procedimento geral de clonagem molecular é obter a inserção desejada, que pode ser derivada do DNA ou mRNA de qualquer tipo de célula. O vetor ideal e seu organismo hospedeiro são então escolhidos com base no tipo de inserção e no que será feito com ela. Uma reacção em cadeia da polimerase, ou método baseado em PCR é frequentemente utilizado para replicar o inserto.

Então, usando uma série de reacções enzimáticas, o inserto e a digestão são unidos e introduzidos no organismo hospedeiro para replicação em massa. Os vetores replicados são purificados das bactérias, e após a digestão restrita, analisados em um gel. Os fragmentos purificados em gel são posteriormente enviados para seqüenciamento para verificar se o inserto é o fragmento de DNA desejado.

Vejamos um pouco mais detalhadamente como a clonagem molecular é conduzida. Antes de começar, você vai querer planejar sua estratégia de clonagem, antes de fazer qualquer tentativa de clonagem na bancada. Por exemplo, qualquer vector plasmídeo dado, irá fornecer-lhe um número finito de sítios de restrição para incorporar a inserção através do sítio de clonagem múltipla. Você precisará escolher locais de restrição que não são encontrados em seu insert para que você não o clivagem. Você poderá ficar com uma situação em que será forçado a unir um fragmento rombo com um que tenha uma saliência. Se assim for, então usar o fragmento de klenow para configurar uma ligação de extremidade romba pode ser a sua única opção para obter a inserção no vector desejado. A compreensão das várias ferramentas de clonagem molecular à sua disposição, assim como a elaboração de uma estratégia cuidadosa antes de começar a clonagem pode ser uma imensa economia de tempo.

A fonte de DNA para clonagem molecular pode ser isolada de quase qualquer tipo de amostra de célula ou tecido através de técnicas simples de extração. Uma vez isolada, a PCR pode ser usada para amplificar o inserto.

Após o inserto ser amplificado, tanto ele como o vector são digeridos por enzimas de restrição, também conhecidas como endonucleases de restrição.

Após digerido, o inserto e o vector podem ser executados num gel e purificados por um processo chamado purificação em gel. Com relação ao vetor, esta etapa ajudará a purificar o plasmídeo linearizado do plasmídeo não cortado, que tende a aparecer como um esfregaço de alto peso molecular em um gel.

Após a purificação do gel, o inserto é ligado ou unido ao plasmídeo, através de uma enzima chamada DNA ligase.

De um modo geral, é sempre uma boa ideia estabelecer ligações, de modo a que a proporção de inserção para o vector seja de 3 para 1, o que garante que apenas uma pequena quantidade do vector se auto-ligará. Uma vez estabelecida a ligação no gelo, ela é incubada em qualquer lugar a partir de 14-25˚C de 1 hora até durante a noite.

Próximo, é feita a transformação para introduzir o vector plasmídeo no hospedeiro que o irá replicar.

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As bactérias de transformação que se seguem são incubadas em placas de ágar com antibiótico e incubadas durante a noite a 37°C. Como o plasimídeo contém um gene de resistência a antibióticos, a transformação bem sucedida produzirá colônias bacterianas quando cultivadas em placas de ágar em presença de antibióticos. As colônias individuais podem então ser colhidas da placa transformada, colocadas em meio de crescimento líquido em tubos numerados e colocadas em uma incubadora agitada para expansão. Um pequeno volume de cultura líquida é adicionado a uma placa de ágar numerada, enquanto o resto da cultura passa para a purificação com plasmídeos. O esquema de numeração que denota a identidade das colónias bacterianas das quais os plasmídeos serão eventualmente purificados é mantido durante todo o processo de purificação dos plasmídeos.

Uma amostra de plasmídeo purificado é então cortada com enzimas de restrição. A digestão é então carregada e executada no gel a fim de verificar a presença de inserto, que verificará se a colónia bacteriana foi transformada com um plasmídeo contendo um inserto e não um plasmídeo auto-ligado. As bactérias que se verificou terem sido transformadas com um plasmídeo contendo um inserto, são expandidas para posterior purificação do plasmídeo. O sequenciamento é utilizado como etapa final de verificação para confirmar que o gene de interesse foi clonado.

A clonagem molecular pode ser utilizada para um número quase ilimitado de aplicações. Por exemplo, quando um modelo de mRNA é transcrito reverso para formar cDNA, ou DNA complementar, por uma enzima chamada transcriptase reversa e depois PCR é utilizado para amplificar o cDNA, a clonagem molecular pode ser utilizada para criar uma biblioteca de cDNA – uma biblioteca de todos os genes expressos por um determinado tipo de célula.

A clonagem molecular também pode ser empregada para pegar uma série de genes, ou cluster de genes de uma estirpe bacteriana, reorganizá-los em plasmídeos que são transformados em outra estirpe, de modo que todo um caminho biossintético pode ser recriado para produzir uma molécula complexa.

Por meio da clonagem molecular, uma biblioteca mutante pode ser gerada expressando um plasmídeo alvo em uma estirpe bacteriana especial que usa uma polimerase propensa a erro quando cultivada a determinadas temperaturas. As mutações podem ser caracterizadas por sequenciação. As bactérias transformadas com genes mutantes podem então ser testadas com diferentes drogas ou produtos químicos para ver quais colônias bacterianas evoluíram para ter resistência a drogas.

Alguns agradecimentos à clonagem molecular, genes repórteres podem ser incorporados em plasmídeos de DNA, um gene repórter comum é a proteína fluorescente verde ou GFP, que emite uma fluorescência verde quando exposta à luz UV. Um gene repórter também pode ser inserido em um alfavírus para mostrar infecção em mosquitos e transmissibilidade em células.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVEs sobre clonagem molecular. Agora você deve entender como a clonagem molecular funciona e como a técnica pode ser usada em biologia molecular. Como sempre, obrigado por assistir!