2.19.2.3.3 Condições de Eluição
Soluções de eluição eficazes devem, idealmente, interromper as interacções analito-anticorpo sem afectar adversamente os Abs. imobilizados. Um deslocador é uma molécula de reacção cruzada altamente concentrada capaz de induzir uma dessorção biosespecífica. As moléculas do deslocador competem com as moléculas da substância a analisar, e o grande excesso de deslocador garante uma dessorção quantitativa da substância a analisar. Para um desempenho óptimo, o deslocador tem de cumprir vários critérios: (1) uma alta reactividade cruzada com os anticorpos imobilizados, (2) um tempo de retenção significativamente diferente do dos analitos porque o grande excesso causa um pico proeminente que pode facilmente interferir com a detecção dos analitos, (3) boa estabilidade e alta pureza porque as impurezas presentes em níveis tão baixos como 0,01-0,1% podem perturbar o cromatograma, e (4) baixo preço, características não tóxicas, ausência em amostras reais, e baixa detectabilidade em comparação com os analitos. Além disso, um grande volume de solução de eluição é necessário, o que impõe a reconcentração em um suporte clássico de SPE antes da análise. Consequentemente, condições de eluição que permitam a recuperação completa do analito alvo com um pequeno volume de eluição são preferíveis.
Os íons de cadeia são comumente usados para a eluição de moléculas grandes, como proteínas. Esses íons perturbam a estrutura da água em torno de moléculas grandes, ou seja, anticorpos e moléculas alvo, o que induz uma ruptura das interações hidrofóbicas em estruturas moleculares grandes e entre a substância a ser analisada e o anticorpo. Os íons chaotrópicos mais comuns são cloreto, iodeto, perclorato e íons tiocianato, em concentrações entre 1,5 e 8 mol l-1. No entanto, as várias soluções aquosas que podem ser aplicadas com sucesso para a dessorção de proteínas de EI mostraram ser incapazes de dessorber pequenas moléculas. A dessorção da proteína é provavelmente baseada principalmente em mudanças na estrutura da proteína ligada (desnaturação parcial), e não nas mudanças na estrutura dos anticorpos imobilizados. Portanto, a eluição das pequenas moléculas, que não são sensíveis à desnaturação, necessita de condições muito mais rigorosas. Além disso, com um aumento da temperatura de 4 a 43 °C, a constante de dissociação das interacções anticorpos-analíticos pode ser aumentada em duas ordens de magnitude. Este método não é suficientemente eficaz para ser aplicado à eluição de pequenas moléculas. A eluição com soluções de pH baixo é frequentemente realizada para desorbatar pequenas moléculas de SI, mas são necessárias três unidades de pH do ponto isoelétrico do anticorpo. Este tipo de eluição (mudança de pH sem alterar a força iónica) evita danificar os anticorpos lábeis. Um inconveniente é que grandes volumes ainda são necessários para uma dessorção completa, diminuindo assim os fatores de enriquecimento associados aos procedimentos de extração.
Uma eluição eficiente de pequenas moléculas de um SI pode ser obtida com um volume reduzido de uma mistura modificadora água-orgânica. Como exemplo, a Figura 6 apresenta o perfil de eluição de dois herbicidas, isoproturão e atrazina, após a percolação de uma amostra de água perfurada com cada analito em sua EI correspondente. Vários solventes de eluição (metanol, etanol e ACN) misturados com água foram avaliados.
>Figure 6. Perfis de eluição de atrazina, isoproturão, 2,4,6-triclorofenol e pentaclorofenol da sua EI correspondente utilizando soluções de eluição contendo quantidades crescentes de um solvente orgânico em água acidificada ou não acidificada após a percolação das amostras de água perfuradas em cada analito. ACN, acetonitrilo; MeOH, metanol; EtOH, etanol; AA, ácido acético; TFA, ácido trifluoroacético.
Os perfis de eluição resultantes dependem fortemente da natureza do solvente. Os três solventes testados permitem a eluição completa de ambos os analitos. No entanto, a Nacacomunik apresenta a maior força de eluição: o menor teor deste solvente permite a eluição completa de ambas as substâncias a analisar. Um teor de 40% e 60% de Nacacacomunik é suficiente para recuperar isoproturão e atrazina, respectivamente, enquanto que 60% e 80% de metanol são necessários. Neste caso, a força de eluição do solvente parece estar relacionada com a sua natureza hidrofóbica, sendo a ACN (parâmetro de solubilidade da marca Hildebrand δ = 24,3 MPa1/2) menos polar do que o etanol (δ = 26,0 MPa1/2) e o metanol (δ = 29,7 MPa1/2). Estes resultados parecem indicar que as interações entre os herbicidas e seus correspondentes anticorpos são principalmente hidrófobos por natureza. A presença de solventes não polares reduz o componente de ligação hidrofóbica da interação entre o anti-corpo e o antagonista. Entretanto, também afeta a estabilidade das ligações hidrofóbicas, mantendo a estrutura terciária do anticorpo, e resulta na liberação do antígeno. Estes exemplos relacionados com a eluição da atrazina ou do isoproturão a partir do seu IS correspondente mostram que uma eluição eficiente será obtida pela adição directa de uma elevada quantidade de metanol ou ACN, 70-80%, na fracção de eluição. Esta alta quantidade de modificador orgânico permitirá reduzir ao máximo o volume da fração de eluição, permitindo assim a concentração do analito no eluato. É preciso ter cuidado para que a escolha do modo de ligação seja compatível com estas condições de eluição. O uso de ligação nãocovalente evita a possibilidade de aplicar uma quantidade tão elevada de modificador sem o risco de perturbar a ligação dos anticorpos do adsorvente. O uso de um processo sol-gel para a imobilização de anticorpos também limita a possibilidade de utilização de uma grande quantidade de solvente orgânico. Foi demonstrado que uma grande quantidade de modificador orgânico como os anticorpos causa a lixiviação de anticorpos da matriz sol-gel.8
Uma combinação de solvente orgânico e ácido orgânico é às vezes necessária. A Figura 6 também apresenta o perfil de eluição de 2,4,6-tricorofenol e pentaclorofenol de um anti-pentaclorofenol IS usando uma mistura hidro-orgânica com e sem adição de um ácido à solução eluente. O triclorofenol pode ser completamente recuperado utilizando água/ACN (20:80, v/v) ou água/ACN (30:70, v/v) acidificada a pH 3 utilizando ácido trifluoroacético (TFA). Quando a acidificação foi alcançada por 1% (v/v) de ácido acético (AA), uma mistura contendo apenas 30% de ácido acético foi eficaz para a eluição. Em contraste, a eluição do pentaclorofenol, que tem maior afinidade com os PAbs do que o triclorofenol, foi impossível com o ACN puro ou o ACN acidificado pelo TFA. A dessorção só pôde ser obtida com água/ACN 20:80 (v/v) contendo 1% AA (v/v).
Por isso, na maioria dos procedimentos off-line, incluindo aqueles recomendados usando IS comerciais de uso único, a dessorção é obtida com uma alta porcentagem de um solvente orgânico, às vezes com pH baixo.
Em conclusão, a escolha das condições de eluição depende primeiro da afinidade entre os anticorpos e os analitos. Depende também da natureza do analito, devido à relação entre as interações eletrônica e hidrofóbica envolvidas nas interações antígeno-anticorpo. Finalmente, depende da estratégia de imobilização dos anticorpos; a ligação não-vigalente impede o uso de grandes quantidades de solventes orgânicos.