Ensaio de Invasão

Materiais:

Falcon 24 placa de cultura de tecidos do poço

Inserção de cultura de células Falcon:8μm tamanho do poro, formato 24 poço

Cat# 3097

Matrigel (Diluído emDMEM/F12)

5% Glutaraldeído em 1XPBS

0.5% Toluidina Azul em 2% Na2CO3

Preparação da Câmara Boyden:

Utilizando pinças esterilizadas removem as inserções da parede celular da sua embalagem e colocam-nas em poços de uma placa de 24 poços.
Lave os insertos 2 vezes com 300μl DMEM/F12

(Cuidado para não espetar na membrana)

Adicionar 20μl de 1:6 Matrigel diluído (2-3 mg/ml de proteína) ao centro de cada inserção de poço de células. Espalhe suavemente o Matrigel por toda a superfície da membrana.
Colocar os insertos revestidos na incubadora para permitir a solidificação do Matrigel durante 20-30 minutos.

Preparação de células para o ensaio:

Trate e cultive as células de acordo com as condições experimentais. Pode ser desejável sincronizar as células para o mesmo estado de crescimento.
Tripsinização e contagem de células
Remover a tripsina e ressuspender com meio fresco.
Células da placa 1X105 em 200 μl de meio definido na câmara superior.

O tempo varia para diferentes linhas celulares e pode ser de até 48 horas para células menos invasivas.

Fixação e Coloração:

Após cultura, aspirar o meio da câmara inferior
Adicionar 0,5 ml de Glutaraldeído a 5% em 1XPBS, incubar por 10 min. @ R.T
Solução de Glutaraldeído Espirado, lavar cada poço 3 vezes com D.W
Adicionar 0,5 ml de solução de coloração 0,5% de Toluidine Blue na câmara inferior, incubar durante 10-20 min @ R.T
Solução aspirada das câmaras superior e inferior, lavar a câmara inferior 3 vezes com D.W
Limpar cuidadosamente a superfície interna da câmara superior com um cotonete. (Cuidado para não pressionar com demasiada firmeza, a membrana pode saltar.) As células invadidas ficarão no centro da parte inferior da membrana.
Contar o número de células com q 20X objectivo do microscópio. Conte pelo menos 3 campos por membrana.