Introdução

Como um pó branco, incolor e cristalino, a sodiumazida (NaN3) é classificada como uma substância altamente tóxica. Os seus efeitos tóxicos são semelhantes aos do cianeto, e lesiona os sistemas nervoso e cardiovascular, os olhos e a pele. Este toxicelement torna-se activo rapidamente após a ingestão, e os seus principais efeitos ocorrem várias horas após a ingestão oral, dependendo da quantidade ingerida (1,2). A exposição ao NaN3 pode induzir um número de sintomas dentro de minutos, incluindo náuseas, vómitos, dores de cabeça, agitação, tonturas, fraqueza, respiração rápida e batimentos cardíacos irregulares (3). Quantidades elevadas deste elemento tóxico induzem imediatamente convulsões, perda de consciência, baixa frequência cardíaca e tensão arterial, e insuficiência respiratória, acabando por conduzir à mortalidade (3). Dentre os mecanismos de ação demonstrados do NaN3, o mais relevante é a inibição do complexo de cadeia respiratória de citocromec oxidase-respiratória (4). Estudos anteriores revelaram que NaN3, um inibidor do complexo IV (Cox IV), pode induzirapoptose em neurônios corticais primários, que é caspase-3 dependente e associado à liberação do citocromo c (5).

Na biossíntese mitocondrial, a cadeia promotora da Cox IV pode ser ativada por fatores respiratórios nucleares (Nrf)-1/2. Concomitantemente, o Nrf pode ser ajustado regulando a atividade dos genes que codificam o fator de transcrição mitocondrial A(Tfam) para regular indiretamente os níveis de expressão dos genes da cadeia respiratória. O Nrf-1/2, Tfam, peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α (Pgc-1α) e outros co-activatorsconstituem a cascata de sinais Pgc-1α, que serve um papel central numa rede reguladora que rege o controlo transcricional da biogénese mitocondrial e da função respiratória. Nesta cascata de sinais, o Pgc-1α primeiro ativa o Nrf-1/2 ao invés de ligar-se diretamente ao DNA mitocondrial, e o Nrf-1/2 induz a ativação do Tfam em combinação com o promotor do Tfam e aciona a transcrição e replicação do DNA mitocondrial, levando ao aumento dos níveis de expressão das proteínas mitocondriais(6). Ao mesmo tempo, a Pgc-1α pode ser ativada por CaN-, Ca2+/calmodulino-dependente de proteinase (CaMK)-, proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK)- e via de sinalização dependente de ciclina (7). No presente estudo, células PC12 foram utilizadas para gerar um modelo de neurônio dopaminérgico, e os efeitos e mecanismos do NaN3 nas vias associadas ao Pgc-1α nas células PC12 foram investigados, para identificar se a toxicidade induzida pelo NaN3 em células PC12 cultivadas e os mecanismos subglicingmecânicos envolvidos nesses efeitos.

Materiais e métodos

Materiais

Feocromocitoma de Rato As células PC12 foram compradas da coleção Cell Bank of Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China). A solução de NaN3(Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) foi dissolvida na solução salina estéril para fazer uma solução de reserva de 1 M, que foi subseqüentemente diluída para as concentrações desejadas antes da experimentação. Um kit de ensaio de apoptose TUNEL de uma etapa (C1090),Anexo em V-fluoresceína isotiocianato (FITC) Kit de detecção de apoptose (C1063), Adenosina melhorada 5′-trifosfato (ATP) Kit de ensaio (S0027), JC-1 Kit de Ensaio de Membrana Mitocondrial (C2006) e Kit de Ensaio de Espécies Reativas de Oxigênio (S0033) foram fornecidos peloBeyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China).

Cultura de células e ensaio de viabilidade

CélulasPC12 foram mantidas no meio Dulbecco’s modificadoEagle (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA) e 1%Antibiótico Antimicótico solução constituída por 10.000 U de penicilina e 10.000 U de estreptomicina. As células foram incubadas a 37°C em atmosfera inalada de 5% de CO2 e sempre utilizadas a 70-80% de confluência.

A viabilidade das células PC12 foi determinada usando um Kit de Contagem de Células (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, China). As células foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de 1×105/poço. Após cultura 24 h, as células foram tratadas com NaN3 (0-80 mM) e incubadas durante 12, 24, 48 e 72 h para estabelecer o modelo de lesão celular. Posteriormente, 10 µlCCK-8 solução (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) foi adicionada ao poço do dedo do pé e incubada por mais 2 h sob as condições padrão (37°C e 5% CO2). A absorvância no comprimento de onda de 450 nm foi determinada por ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). A celviabilidade foi calculada de acordo com a densidade óptica média de 6 poços. Os experimentos foram conduzidos em triplicata. As concentrações apropriadas de NaN3 para uso em subseqüentes experimentos foram determinadas de acordo com os resultados dos ensaios de celviabilidade.

Morfologia nuclear de células DAPI-manchadas de NaN3

Células de NaN3 foram expostas a 0, 10, 20 e 40 mMNaN3 durante 24 h. A fim de distinguir a morte celular programada da morte celular não-apoptótica, os núcleos foram corados com 10µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois fixadas com 4%paraformaldeído à temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente, as células fixas foram coradas com DAPI (1:5.000) durante 5min e, em seguida, lavadas com PBS. As imagens de fluorescência foram obtidas com um microscópio de fluorescência Leica DMI (ampliação, ×400).

Medição da taxa apoptótica

Um kit de detecção de apoptose V-FITC/PI (Beyotime Institute of Biotechnology) foi usado para determinar a apoptose das células de acordo com as instruções do fabricante: As taxas apoptóticas de células PC12 de controle (0 mMNaN3) e PC12 expostas a 10, 20 e 40 mMNaN3 durante 24 h foram medidas por citometria de fluxo (FC500;Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EUA). As análises estatísticas foram realizadas com o software estatístico SPSS v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, EUA).

Medição do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

ΔΨm é um parâmetro significativo da mitocondriafunção. Foi avaliado através da coloração com JC-1, uma sonda fluorescente. Os experimentos foram repetidos em triplicata, e foram realizados da seguinte forma: As células PC12 de controle foram tratadas com 0 mMNaN3; e as células PC12 experimentais foram expostas a 10, 20 e 40 mM NaN3 durante 24 h. Posteriormente, de acordo com o protocolo do fabricante (C2006; kit de análise do potencial de membrana mitocondrial; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China), as células foram incubadas com o meio contendo JC-1 (1X) a 37°C durante 20 min, as células foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e coletadas com meio fresco sem soro. Concomitantemente, o controle positivo foi tratado com cianeto de carbonilo3-clorofenilidrazona (CCCP), um inibidor, (10 µM) a 37°C por 20 min. Em seguida, a fluorescência vermelha/verde foi determinada pela FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). As razões de intensidade de fluorescência vermelha sobre a fluorescência verde representaram o nível de ΔΨm.

Medição da produção de espécies de oxigênio reativas(ROS)

ROS em células PC12 foi avaliada usando um kit de ensaio de espécies de oxigênio reativo (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, China). A geração intracelular de ROS foi avaliada por meio de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetada (DCFH-DA),uma sonda fluorescente. A ROS intracelular oxida o DCFH-DA, produzindo o composto fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF), e a intensidade da DCFfluorescência é considerada paralela ao montante de ROS formado, de acordo com as instruções do kit de ensaio ROS.Os experimentos foram repetidos em triplicata e realizados da seguinte forma: o controle positivo foi tratado com concentração específica de Rosup(50 mg/ml); as células PC12 controle foram tratadas com 0 mMNaN3; e as células PC12 experimental foram expostas a 10, 20 e 40 mM NaN3 durante 24 h. Além disso, as células PC12 foram tratadas com DCFH-DA (10 mM) dissolvidas em DMEM livre de soro (1:1.000)durante 20 min a 37°C e, em seguida, lavadas três vezes com DMEM livre de soro. O controle positivo foi tratado com Rosup, para induzir a produção de ROS. A produção de ROS foi determinada pelo FCM (FC500;Beckman Coulter, Inc.). As intensidades médias de fluorescência (MFI) representaram os níveis de ROS.

Medição do conteúdo de ATP celular em células CP12

Experimentos foram repetidos em triplicata e realizados da seguinte forma: Células PC12 de controle foram tratadas com 0 mMNaN3; e células PC12 experimentais foram expostas aNaN3 em diferentes concentrações (10, 20 e 40 mM) durante 24 h. Posteriormente, o conteúdo celular de ATP foi determinado usando o kit de ensaio ATP aFirefly Luciferase (Beyotime Institute ofBiotechnology) de acordo com o protocolo do fabricante.

Análise de blot ocidental

Células de CP12 foram expostas a 0, 10, 20 e 40 mMNaN3 durante 24 h, lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (Beyotime Institute of Biotechnology) contendo inibidor de aprotease e centrifugadas a 13.362 × g durante 10 min a 4°C para coletar os sobrenadantes. Subsequentemente, as concentrações de proteínas foram determinadas utilizando o kit BCA (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Quantidades iguais de proteínas (90 µg) foram submetidas a 10 e 12% de SDS-PAGE, e então transferidas para membranas de polivinilidenefluoreto (0,45 µm) usando uma Unidade de Eletrotransferência de Semidry (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). Após bloqueio com 5% de albumina de soro bovino em TBS contendo 0.1% Tween-20 (TBST)durante 2 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpos primários contra Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, EUA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1.000), Tfam (Abcam;1:1.000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc., EUA), (Tecnologia de Sinalização Celular, Inc.; 1:1.000), p-extracelular kinase(Erk)1/2 (Tecnologia de Sinalização Celular, Inc.; 1:1.000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-associada à proteína X (Bax; Santa CruzBiotecnologia, Inc.; Bcl-2)-associada à proteína X (Bax; Santa CruzBiotecnologia, Inc.; 1:1.000), p-p38 MAPK Dallas, TX, EUA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotecnologia, Inc.; 1:200) e citocromo c (Santa CruzBiotecnologia, Inc.; 1:200) a 4°C durante a noite. As membranas foram lavadas com TBST e incubadas com peroxidase de rábano (HRP) – anticorpos secundários conjugados (coelho; nº de gato. A0208;1:1,000; ou rato; gato. no. A0216; 1;1.000; ambos Beyotime Instituteof Biotechnology) durante 1 h à temperatura ambiente. Bandas imunoreativas foram visualizadas pelo sistema de quimioluminescência melhorado (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, China) e quantitativamente analisadas com Image J versão l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), e β-actin foi selecionado como o loadcontrol.

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram conduzidas com o software SPSSstatistical v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Os dados são expressos como a média ± desvio padrão do erro padrão da média. A significância estatística das diferenças entre os grupos foi determinada pela análise de variância unidirecional seguida pelos testes post-hoc de Bonferroni. P<0,05 foi considerado para indicar diferença astatisticamente significativa. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

Resultados

NaN3 inibe o crescimento de células PC12

O efeito da exposição a NaN3 sobre a proliferação de células PC12 foi avaliado pelo ensaio CCK-8. As células foram desafiadas com diferentes concentrações (0-80 mM) de NaN3 durante 12-72 h. A tabela I e Fig. 1A-D indicam que a viabilidade celular foi reduzida por NaN3 de forma dependente da concentração de NaN3. Quase 100% das células morreram após a exposição a 80 mM de NaN3 durante 72 h, indicando que o NaN3 induziu acentuadamente a morte celular, e a ocittoxicidade do NaN3 foi detectada de uma maneira dose- e dependente do tempo. A exposição ao NaN3 na concentração de 20 mM por 24 h causou a morte celular acentuada nas células CP12 (50%). Portanto, as células cultivadas por 24 h foram utilizadas para experimentos subseqüentes.

Morfologia das células

Na coloração DAPI, as alterações morfológicas das células PC12 foram observadas por microscopia de fluorescência após exposição a diferentes concentrações de NaN3. A fragmentação dos núcleos celulares expostos ao NaN3 durante 24 h foi observada, e a retração dos núcleos celulares e a condensação de cromatina foram aumentadas de forma clara com a concentração de NaN3 nas células PC12 comparadas ao controle. Nessas células, as células apoptóticas são mais pequenas e mais brilhantes em comparação com as células normais. Além disso, o número de células apoptóticas e a intensidade da fluorescência verde foram aumentados em células expostas a NaN3 (Fig. 2).

Determinação da taxa deApoptose pela coloração do Anexo V-FITC

Células mortas ou células apoptóticas tardias que possuem integridade da membrana de células perdidas podem ser coradas por iodeto de propidio. Devido à perda da integridade desta membrana celular, o Anexoin V-FITC pode entrar no citoplasma e combinar com a fosfatidilserina dentro da membrana celular, exibindo fluorescência verde em células mortas.Fig. 3 demonstra que os números de células apoptóticas foram 5,03, 8,02, 43,77 e 78,67%(P<0,05) nas células PC12 após exposição a NaN3 em diferentes concentrações (0, 10, 20 e 40 mM) durante 24 h, respectivamente. Estes resultados confirmaram adicionalmente que a apoptose celular induzida por NaN3 em um dose-dependentmanner.

Alterações no potencial da membrana mitocondrial (ΔΨm)

Mitocôndria são geralmente considerados os principais órgãos reguladores envolvidos na viabilidade celular. Portanto, ΔΨm foi utilizado como indicador da função mitocondrial. As células PC12 foram coradas com JC-1, um corante catiônico que exibe potencial-dependente de acúmulo nas mitocôndrias. A fluorescência vermelha (J-agregates), representando mitocôndrias ativas com potencial de membrana estável, foi observada em um pequeno número de células expostas acentrações crescentes de NaN3. Em contraste, a fluorescência verde (J-monomer), representando mitocôndrias apoptóticas com mitocôndrias danificadas ΔΨm, foi observada em um pequeno número de células. A razão de fluorescência vermelha e verde diminuiu gradualmente no grupo controle (Fig. 4).

Acumulação de ROS mitocondriais induzida por NaN3

É bem conhecido que as mitocôndrias são a fonte primária das ROS celulares, e as ROS servem um importante papel de inativação da sinalização apoptótica. Portanto, o papel das ROS na morte celular induzida por PC12 induzida por NaN3 foi adicionalmente investigado. A Figura 5 indica que as intensidades de fluorescência nas células de controle e exposição celular a NaN3 em várias concentrações (0, 10, 20 e 40 mM) por 24 h foram 3,65, 6,99, 18,63 e 39.35, respectivamente, indicando que a exposição à NaN3 aumentou significativamente a produção de ROS mitocondrial em relação ao grupo controle(P<0,05). Esses resultados sugeriram que a anafaloptose induzida por NaN3 melhorou a produção de ROS intracelulares.

NaN3 regula a produção de energiamitocondrial de ATP celular

Para avaliar o conteúdo de ATP em células PC12 expostas a NaN3, a unidade de luminescência relativa (RLU) foi determinada de forma quantitativa por um luminômetro. Fig. 6 indica que a produção de ATP mitocondrial inibido com NaN3 diminuiu gradualmente o nível de ATP celular (P<0,05).

Níveis de expressão de Pgc-1α e proteínas associadas àapoptose nas células PC12

A expressão de Pgc-1α no nível de proteína foi significativamente diminuída após a exposição a NaN3 em comparação com o controle (P<0,05). Além disso, Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2,Nrf-2 e Cox IV são alvos bem conhecidos a jusante de Pgc-1αdynamics em vários tipos de células (8). O presente estudo identificou que a exposição a NaN3 inibiu significativamente a dinâmica do Pgc-1α de maneira dose-dependente (P<0,01; Fig. 7A).

Além disso, a exposição a NaN3 não pregulou os níveis de expressão de Bax e citocromo c, enquanto que a exposição a NaN3 regulou os níveis de expressão de Bcl-2 e procaspase-3(P<0,05). A proporção de Bax/Bcl-2 também foi significativamente aumentada em relação ao grupo controle (P<0,05; Fig. 7B).

Os níveis de expressão de proteínas de outros membros importantes, incluindo CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK e p-p38 MAPK, também foram avaliados. Os resultados indicaram que o NaN3 aumentou a expressão de CaN e a fosforilação de CaMKII e p38 MAPK em relação ao grupo controle, enquanto os níveis de expressão de CaMKII total e p38 MAPK não foram alterados. Além disso, as razões de p-CaMKII/CaMKII e p-p38/p38 MAPK no grupoNaN3 foram significativamente aumentadas em relação às do grupo controle (P<0,01; Fig. 7C).

Discussão

Para determinar se o NaN3 inibiu a proliferação de células PC12, o número de células tratadas na faselogarítmica foi comparado com o número de células não tratadas-controle. O crescimento celular foi inibido em ~75% após 24 h de exposição a 20 mM de NaN3. Portanto, esta concentração foi utilizada para experimentos subseqüentes. A apoptose envolve alterações na morfologia incelular, incluindo bolhas de membrana, retração celular, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e fragmentação de DNA(9). Além disso, para analisar a morfologia fenuclear da apoptose e a taxa apoptótica, as células foram desafiadas com NaN3 0, 10, 20 e 40 mM durante 24 h. Após o tratamento, as células foram então coradas com DAPI e AnexoinV-FITC/PI, e a distribuição dos núcleos foi analisada. Os resultados confirmaram que a exposição a NaN3 induziu a apoptose das células PC12 de forma dependente da concentração.

Mitocôndrias estão envolvidas em numerosas funções metabólicas, incluindo manutenção do pH intracelular e produção de ROS, que promovem e regulam a apoptose celular (10). As marcas da apoptose celular são precedidas por alterações mitocondriais, incluindo uma perda de ΔΨm, aumento da produção de energia (ATP) e aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial. Estudos anteriores sugeriram que a ROS desencadeia danos à cadeia respiratória mitocondrial e induz a perda do ΔΨm, que são os fatores que medeiam ou amplificam a disfunção neuronal durante o curso da então neurodegeneração, levando, consequentemente, ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas (11,12).Sabe-se que o NaN3 impulsiona a degeneração e a excitotoxicidade, aumentando o potencial de permeabilidade da membrana mitocondrial através da peroxidação lipídica (13-15), e o NaN3 exerce sua ação tóxica primária, inibindo a função da citocromo oxidase na cadeia de transporte eletrônico mitocondrial e impedindo a produção de ATP (4). No presente estudo, a FCM foi utilizada para identificar ΔΨm e a produção de ROS em células PC12. Além disso, a ATPsíntese em mitocôndrias foi examinada após a exposição a concentrações tovariantes de NaN3. A ruptura da membranaplasmática, o aumento da produção de ROS mitocondrial e a diminuição do conteúdo de ATP celular observados sugeriram que a exposição a NaN3 induziu a apoptose em células PC12.

Morte de células mitocondriais podem ser ativados estímulos bimúltiplos, incluindo o programa de desenvolvimento, dano ao DNA, estresse reticulum endoplasmático, fator de crescimento e privação de nutrientes, infecção viral e estresse oxidativo (16). Como membro da crescente família de co-reguladores nucleares, a Pgc-1α pode ativar um grande conjunto de genes e regular os níveis de expressão dos genes envolvidos no metabolismo energético em resposta às vias de sinalização que medeiam a atermogênese, gluconeogênese, comutação do tipo de fibra muscular e biogênesemitocondrial (17).Esses co-reguladores existem e funcionam em grandes complexos multiproteicos, nos quais, ao invés de se ligarem ao DNA, eles regulamNrf-1/2 e Tfam e modulam sua potência transcripcional, burlando as subseqüentes interações bioquímicas necessárias para a indução ou repressão da transcrição de genes (8). Além disso, o Nrf-1/2 também controla indiretamente a expressão de genes codificados com DNA mitocondrial, induzindo os Tfam A, B1 e B2 codificados nuclearmente (Tfam,Tfb1m e Tfb2m, respectivamente), que são os reguladores da transcrição e replicação do genoma mitocondrial (18). Estudos anteriores demonstraram que o NaN3 é um inibidor do complexo da cadeia mitocondrialrespiratória IV, que é freqüentemente afetado por distúrbios mitocondriais primários (19,20). No presente estudo, a expressão do sinal Pgc-1α em cascata, incluindo as proteínas da família Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 e Tfam) e Cox IV, foi primeiramente examinada em células PC12 para verificar se os eventos sinalizadores estavam envolvidos naapoptose induzida por NaN3. Os resultados sugeriram que a anafilaxia induzida por NaN3 estava associada aos níveis de expressão das proteínas Pgc-1αfamily e Cox IV na via de sinalização mitocondrial. Quando as concentrações de NaN3 foram aumentadas, os níveis de expressão dessas proteínas foram significativamente diminuídos, indicando que elas podem estar envolvidas na ativação e desenvolvimento da apoptose.

Conversamente, o complexo IV pode desencadear a apoptose em neurônios corticais primários, que é caspase3-dependente e associado à liberação do citocromo c (5). É bem conhecido que as mitocôndrias são reguladores chave da apoptose celular. As proteínas da família Bcl-2 são os importantes iniciadores da via apoptótica mitocondrial. Esta família inclui as proteínas pró-apoptóticas Bax, Bcl-2 homólogo antagonista/ assassino e agonista associado à Bcl-2 da morte celular e as proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e Bcl-extra grande (Bcl-xL). Células insalubres, Bax é uma proteína citosólica inativa, mas é translocada para a mitocôndria durante a apoptose. Ela exerce efeitos itspro-apoptóticos ao formar um poro na outermembrana mitocondrial, através do qual o citocromo c é liberado no citoplasma, levando à ativação da caspase 3 (21). As proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL suprimem a função do Bax, mantendo a integridade da membranamitocondrial, o que impede a liberação de citocromo c e a ativação da caspase 3 (22). No presente estudo,o NaN3 aumentou os níveis de Bax pró-apoptótico e o citocromo c e diminuiu os níveis de antiapoptótico Bcl-2 eprocaspase-3, indicando que o NaN3 inicia a sinalização de apoptose mitocondrial em células PC12.

Além disso, os níveis de expressão dos ativadores Pgc-1αco são altamente induzíveis no nível transcripcional através de uma variedade de vias de sinalização a montante. Por exemplo, a expressão de Pgc-1α é induzida por exercício e exposição ao frio sob o controle da sinalização de estresse via adenosina celular Ca2+ e adenosina cíclica 5′ sinalização de monofosfato (cAMP) (23). A transcrição de Pgc-1α pode ser embelezada por CaMK, calcineurina, β-adrenergic receptor/cAMP e p38MAPK (24-26). Além disso, a p38 MAPK pertencente à família MAPK tem uma função central na proliferação celular, diferenciação, transformação e apoptose, já que a ativação da apoptose pode induzir Pgc-1α através da fosforilação direta (27). No presente estudo, os níveis de expressão das proteínas nas vias de sinalização de Ca2+ (pan-calcineurina A e p-CaMKII/CaMKII) e p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK e p-Erk1/2) foram examinados para investigar os efeitos da NaN3 na Ca2+homeostase intracelular e p38 MAPK. Os dados indicaram que os níveis de proteína da pan-calcineurina A, e as razões p-CaMKII/CaMKII e p-p38MAPK/p38 MAPK foram aumentadas e o nível p-Erk1/2 foi diminuído no grupo tratado com NaN3, sugerindo queNaN3 desencadeou a apoptose das células PC12 de forma adose-dependente, e tal ativação foi associada com as vias Ca2+ e p38 MAPK. Em conjunto, os resultados experimentais confirmaram que o NaN3 pode induzir a apoptose das células PC12, ativando as vias Ca2+ e p38 MAPK. O presente estudo revelou pela primeira vez que o NaN3 induziu a apoptose mediada por NaN3 nas células PC12 através das vias de sinalização associadas ao PC12, incluindo Ca2+/p-CaMKII e p38 MAPK.

Em resumo, o presente estudo demonstrou que o NaN3 pode induzir a apoptose das células PC12. Com o objetivo de elucidar o mecanismo tóxico subjacente à exposição ao NaN3, foram examinados os níveis de expressão de uma série de pró-apoptócitoses (Bax e citocromo c) e proteínas anti-apoptócicas (Bcl-2,procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII e Pgc-1α). Os resultados confirmaram que as proteínas pró-apoptóticas exerceram efeitos pró-apoptócicos nas células PC12 via ativação e fosforilação de CaMKII e p38 MAPK, o que estimulou a ativação de Pgc-1α e procaspasa-3 nas células PC12. Os dados fornecem uma base para estudos posteriores que investigam os mecanismos de ação NaN3 a nível molecular. Estudos futuros podem incluir a adição de agentes protetores, por exemplo o inibidor da divisão mitocondrial 1, um derivado da quinazolinona que é um inibidor da divisão mitocondrial recentemente identificado, antes do tratamento com NaN3, a fim de investigar os efeitos neuroprotetores do agente protetor na atenuação daapoptose induzida por NaN3 nas células PC12, e para elucidar adicionalmente o mecanismo subjacente.

Acknowledgements

Não aplicável.

Fundamento

O presente estudo foi apoiado financeiramente pelos subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (grantno. 81571848) e pelo Desenvolvimento do Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados utilizados ou analisados durante o presente estudo estão disponíveis no autor correspondente no reasonablerequest.

Contribuições dos autores

YZ e SZ conceberam e desenharam o estudo. YZ, JH, HX, TG e YW adquiriram os dados. YZ, JH e HX analisaram e interpretaram os dados, e redigiram o manuscrito. Todos os autores revisaram criticamente o manuscrito, e leram e aprovaram a versão final do manuscrito.

Aprovação ética e consentimento toparticipativo

Não aplicável.

Autorização para publicação

Não aplicável.

Interesses concorrentes

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Glossário

A abreviaturas

A abreviaturas:

NaN3	azida de sódio
Cox IV	complexo IV
Tfam	FactorA de transcriçãomitocondrial
Nrf-1/2	fator respiratório nuclear-1/2
CaN	pan-calcineurina A
Pgc-1α	peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α
PC12 >	feocromocitoma de rato
ΔΨm	potencial de membranamitocondrial
CCCP	cianeto de carbonilo3-clorofenilidrazona
ROS	espécies de oxigênio reativo
FCM	citometria de fluxo
MAPK	mitogénio-proteína quinase ativada

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