Estudos de investigação
Nos nossos estudos, examinámos uma cultura da UE, Pisum sativum (ervilha). As ervilhas são susceptíveis a uma vasta gama de vírus, incluindo o Pea enation mosaic virus, Pea early browning virus, e uma gama de vírus do grupo Y Potato virus (Potyviridae). Dentro deste último grupo, o Bean yellow mosaic virus, o Bean common mosaic virus, o Pea mosaic virus e o Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) são todos patógenos importantes. Em particular, estudamos o PSbMV, para o qual todas as cultivares comerciais de ervilhas são susceptíveis. Esta susceptibilidade é agravada pelo facto de este vírus não só ser transmitido de planta para planta pelo seu vector afídeo, mas também é transmitido verticalmente de geração para geração na semente. Esta propriedade resultou numa grave contaminação das colecções de germoplasma de ervilha e fornece um meio muito eficaz para dar uma infecção precoce e generalizada das culturas logo após a germinação da semente. Considere que uma eficiência de transmissão de sementes de apenas 0,1% resultaria em 10.000 infecções após a sementeira de sementes a 107/hectare, e a importância da transmissão de sementes torna-se aparente. Atualmente, este problema é combatido por testes eficientes pós-colheita de amostras de sementes por imunodetecção da proteína da casca do vírus, e rejeição de lotes de sementes contaminadas. Como alternativa, e como a transmissão de sementes em uma variedade de cultivares de ervilha varia de 0 a 100%, temos investigado se a resistência à transmissão de sementes poderia ser criada em linhas melhoradas de ervilha. Nos cruzamentos de teste e retrocruzamentos entre linhas sem transmissão ou transmissão de 60-80%, a resistência comportou-se como um caráter dominante, embora nas gerações F2 e BC2 não se segregasse como um traço mendeliano. A natureza quantitativa do fenótipo sugeriu que a transmissão de sementes seria difícil de incluir como um traço de resistência num programa de reprodução convencional.
A resistência natural à PSbMV foi identificada em acessos de ervilhas do Norte de África e Ásia, embora, até agora, estes genes recessivos não tenham sido introgrados em linhas comerciais. A análise genética mostrou que estes genes estão agrupados com outros genes recessivos com diferentes especificidades de vírus poty em dois locais do genoma da ervilha. Os genes sbm-1, sbm-3 e sbm-4, conferindo resistência aos pathotypes PI, L-l e P4 da PSbMV, respectivamente, estão localizados no cromossoma 6, enquanto que o sbm-2 também confere resistência ao pathotype L-l está localizado no cromossoma 2. Embora esta organização seja sugestiva de conversão e translocação de genes locais entre os cromossomos 2 e 6, outras evidências sugerem que os dois clusters de genes podem ter origem e função distintas. Usando vírus híbridos recombinantes feitos entre diferentes patótipos, o determinante da avirulência do vírus foi definido como a proteína genomelinked do vírus (VPg) para sbm-1 . Uma análise estrutural e funcional do gene sbm-1 é o tópico de um projeto EC-Biotecnologia # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) envolvendo grupos de pesquisa e a indústria da Dinamarca, Finlândia, Espanha e Reino Unido.
Caracterização do gene sbm-1 proporcionará recompensas intelectuais e práticas particulares. Como aproximadamente 20% de todos os genes de resistência a vírus e aproximadamente 40% dos genes que conferem resistência ao potyvirus são recessivos, compreender como o sbm-1 funciona e o que controla a especificidade dos genes de resistência ao potyvirus adjacentes será importante para uma ampla gama de doenças. No entanto, o projeto sbm- também tem desafios técnicos, não menos importante em ter que lidar com o tamanho e redundância dentro do genoma da ervilha. O genoma da ervilha é aproximadamente 5 x 109 pares de bases por genoma haplóide, cerca de 50 vezes maior que o da Arabidopsis thaliana. A clonagem de genes em ervilha com base em mapas não foi alcançada e ainda não estão disponíveis grandes bibliotecas de inserções. Entretanto, existe o potencial no sbm-1 para identificar uma nova classe de genes de resistência. Os genes de resistência clonados até agora de outras espécies dividem-se em duas classes. Os genes de resistência dominantes que funcionam contra vírus, fungos e bactérias específicos enquadram-se amplamente na classe “NBS-LRR” e medeiam uma resistência hipersensível à infecção. O único gene recessivo a ser clonado (mlo) mede uma resistência não específica da raça ao oídio na cevada e está também associado à localização do patógeno em células mortas. Funcionalmente, o Mlo actua como um regulador negativo da resistência constitutiva. Em contraste, o sbm-1 é específico da raça (ou patótipo) e não está associado com a morte celular. A partir destas comparações, vários mecanismos funcionais para o sbm-1 parecem possíveis. Primeiro, podemos ver o sbm-1 como um fator de suscetibilidade dominante, necessário para auxiliar na replicação do vírus. Isto encaixaria com o provável envolvimento do VPg na replicação do RNA viral e com a observação de que os protoplastos de plantas resistentes não mostram nenhuma replicação detectável do vírus. Segundo, como o Mlo, o Sbm-1 poderia atuar como um regulador negativo de resistência, embora as diferenças de especificidade do mlo colocassem o sbm-1 em uma classe distinta de genes de resistência. Terceiro, o sbm-1 poderia ser um alelo de resistência fraco dominante mas dose-dependente. Favorecemos a primeira opção como a mais direta e simples interpretação.
Para nosso componente no projeto EC-Biotecnologia, optamos por usar abordagens genéticas para identificar o produto do gene de resistência sbm-1. Após identificar linhas de ervilha adequadas (um par de linhas BC4 carregando alelos homozigotos de resistência e suscetibilidade) uma estratégia cDNA-AFLP tem sido usada para identificar genes expressos provenientes da região introgressada. Até agora, dez cDNAs polimórficos foram identificados. Estes estão sendo mapeados usando famílias recombinantes consanguíneas para confirmar sua origem genômica. Nossa estratégia alternativa é “pescar” o produto do gene sbm-1 usando o sistema de dois híbridos de levedura com a PSbMV VPg como a proteína de isca. Dois cDNAs fortes candidatos e outros oito cDNAs que codificam as proteínas do interator foram identificados a partir de uma biblioteca de cDNAs de ervilha feita a partir de uma linha de ervilha suscetível. Esses cDNAs também estão sendo sequenciados e mapeados.
Como parte de um projeto EC-AIR anterior (# CT94-1171) envolvendo parceiros acadêmicos e industriais na Dinamarca, França e Reino Unido, também exploramos o potencial para desenvolver PDR para PSbMV em ervilhas transgênicas. Como em outros sistemas o gene da replicase viral tinha sido comumente usado para dar PDR ao desencadear o processo de silenciamento de genes pós-transcripcionais (PTGS), usamos o cistron de replicase PSbMV (NIb) para expressão transgênica em ervilhas. A partir de 35 linhas de ervilhas, transformadas com Agrobacterium tumefaciens T- DNA carregando uma construção de terminador 35S -Nib – 35S, e o gene bar como marcador selecionável para tecido transformado na presença do herbicida Bialophos, três linhas foram mostradas como resistentes à PSbMV. Duas dessas linhas levavam uma repetição direta da extremidade de 3′ do gene Nib (NIbIb), já que havia algumas evidências de que arranjos transgênicos complexos tinham mais potencial para iniciar o PTGS. Todas estas linhas exibiram um tipo de RCP denominado “recuperação” onde a inoculação por desafio resulta numa infecção inicial, mas as plantas recuperam rapidamente e não mostram mais sintomas ou acumulação de vírus. Os tecidos recuperados são então resistentes a mais desafios com os isolados de vírus homólogos ou intimamente relacionados. Para avaliar o significado disto no campo onde as plantas podem ser desafiadas com uma população de vírus relacionados, foi avaliada a capacidade dos diferentes isolados de PSbMV de desencadear o PTGS e de serem alvo de PTGS induzido. Isto mostrou que vírus com cerca de 89% ou mais de identidade no cistron NIb poderiam induzir a resistência, embora os requisitos de especificidade para um segundo vírus de desafio ser visto como um alvo possam ser mais elevados. Para referência, os dois isolados PSbMV sequenciados mais divergentes diferem em 89% na região do bico. Esta distinção nos requisitos de especificidade para a ativação e direcionamento no PTGS será uma consideração importante para a aplicação da tecnologia em culturas comerciais. A resistência relativamente ampla aos isolados de PSbMV em ervilhas transgênicas Nib contrasta com a extrema especificidade de patologia observada para os genes naturais de resistência sbm, onde apenas uma ou poucas mudanças no determinante de avirulência do vírus é suficiente para mudar um isolado de PSbMV de avirulento para virulento .
Embora o curto período de infecção inicial, as plantas de ervilha transgênica mostraram bom crescimento e semente definida após inoculação de desafio para dar rendimentos sob condições de estufa equivalentes aos vistos para linhas transgênicas não infectadas ou não transgênicas. Acreditamos que, sujeitas a acordos de licenciamento abrangendo o uso do gene de barra para seleção de plantas transformadas, estas plantas poderiam ser adições úteis ao painel de genes de resistência a patógenos a serem usados no desenvolvimento de novas linhas melhoradas de ervilha.
As plantas transgênicas de ervilha representam as primeiras leguminosas mostrando PDR contra potyviruses e alguns dos primeiros exemplos experimentais nas Leguminosae de plantas mostrando PTGS. Foi valioso, portanto, estabelecer que os princípios que regem o PTGS e a resistência neste sistema suportaram aqueles caracterizados com plantas experimentais mais comumente utilizadas (por exemplo, Nicotiana spp.). Como esperado para o PTGS, a resistência induzida ao vírus foi associada à degradação do RNA transgénico e do RNA PSbMV . Mostramos também que o SCPT foi mediado nestas plantas por um sinal sistêmico gerado durante a fase inicial da infecção pelo vírus, e que este sinal tinha o potencial de mediar a propagação do SCPT, induzindo a metilação na região transgênica transgênica transgênica transgênica transgênica .
Em conclusão, reconhecemos que a indústria agrícola se beneficiaria de ter uma resistência estável e efetiva à PSbMV em ervilhas. A via menos controversa para conseguir isso seria através da incorporação de resistências naturais (seja à transmissão de sementes ou à replicação de vírus) usando estratégias convencionais de cultivo. Nosso entendimento relativamente pobre da complexidade genética da transmissão de sementes de PSbMV significa que isto é improvável de ser útil a curto prazo. Os genes da sbm são mais promissores, embora a falta de marcadores genéticos intimamente ligados e a natureza recessiva da resistência criem algumas dificuldades. Alternativamente, temos demonstrado o potencial para criar resistência através da aplicação de tecnologia transgênica, embora as questões de biossegurança e aceitabilidade pública precisem ser abordadas. Além dessas considerações aplicadas, a pesquisa tem e está gerando materiais e conhecimentos que influenciarão como abordagens relacionadas podem ser usadas em outras plantas de cultivo. Em particular, será importante compreender os mecanismos de ação de uma nova classe de genes de resistência a vírus.