Discussão

O presente estudo identificou uma série de características distintas de colaterais e SMCs que podem estar subjacentes ou contribuir para as características únicas dos colaterais delineadas na Introdução. Verificamos que apesar da tensão de cisalhamento baixa e oscilatória presente nos colaterais na linha de base na ausência de obstrução, seus colaterais estão alinhados com o eixo do vaso no mesmo grau presente nas arteríolas distal-most e nos vasos aorta descendentes com fluxo laminar ortogonal de alta velocidade. As células endoteliais tanto das colaterais como das arteríolas possuem cílios primários, e as colaterais possuem menos deles. As células musculares lisas dos colaterais são contínuas, ao contrário das células dos DMAs. As colaterais têm níveis mais elevados de expressão de genes associados a vias pró e anti-inflamatórias e pró e anti-proliferação, em comparação com os DMAs. Um viés para uma maior taxa de proliferação celular em células murais colaterais é apoiado pela observação de que as colaterais começam a adquirir tortuosidade logo após sua formação no embrião, que aumenta até a meia-idade (16 meses, 49 anos-equivalentes humanos ). Os achados acima fornecem insights sobre as especializações estruturais e moleculares que podem estar subjacentes às características e funções únicas dos vasos colaterais.

Convergência do fluxo sanguíneo em colaterais na linha de base impõe forças de estresse de fluxo/ tensão auditiva baixas e “perturbadas” em suas células murais, ou seja, ou ausência de fluxo ou fluxo muito baixo que oscila de vai-e-vem (~1-10 vezes por minuto) e tem uma média de zero . Isto resulta num aumento da tensão na parede de acordo com a relação Bernoulli. Quando presente em outro lugar na circulação arterial, por exemplo, em bifurcações, no arco interno da aorta ou a jusante de placas, o estresse de cisalhamento baixo e perturbado favorece uma morfologia de CE não-alinhada que está associada com aumento do estresse oxidativo, inflamação, marcadores de envelhecimento e baixa atividade eNOS/NO (ou seja, disfunção endotelial). Surpreendentemente, porém, descobrimos que os CE colaterais têm o mesmo alinhamento (e dimensões celulares) que os CEs em DMAs e a aorta descendente. Não investigamos como este fenótipo estrutural anti-inflamatório é especificado. É possível que uma ou mais das outras características únicas que identificamos estejam envolvidas (veja abaixo). Por outro lado, os dados da Figura 2 para fluxo e tensão de cisalhamento foram obtidos em animais anestesiados. Durante os comportamentos acordados, as colaterais podem ter períodos de fluxo sustentado em uma ou outra direção induzidos por mudanças na atividade metabólica regional no território fornecido pelas árvores arteriais que elas cruzam. Não se sabe se os colaterais contribuem desta forma para a regulação metabólica fisiológica do fluxo sanguíneo e do fornecimento de oxigénio, ou seja, o acoplamento neurovascular no cérebro e a hiperemia funcional noutros locais. No entanto, tais períodos de fluxo unidirecional sustentado poderiam promover a orientação da CE que observamos. Independentemente da causa subjacente, especulamos que o fenótipo alinhado de CE colateral é parte (ou um marcador) de um grupo de mecanismos de proteção que favorecem a manutenção de colaterais e mitigam sua rarefação (Figura 9).

Ao nosso conhecimento, este é o primeiro relatório mostrando que os colaterais de revestimento de ECs e arteríolas têm cílios primários. Elas são muito mais abundantes do que relatadas anteriormente para vasos conduítes de indivíduos saudáveis (isto é, ausentes ou presentes em menos de 1% dos CEs): 18% dos CEs colaterais têm PrC comparado a 28% para os DMAs. Cílios primários em CE foram descritos em 1984 por Haust em aorta de coelhos e humanos com aterosclerose. Relatos subseqüentes descreveram CEs ciliadas em capilares da glândula pineal de um feto humano de 20 semanas de idade, desenvolvendo cílios cardíacos e valvares aórticos, e referências neles], em torno de ateromas, ectópicamente na artéria carótida comum de ratos ApoE-/-, e em indivíduos saudáveis em bifurcações de artérias conduítes e na curvatura interna do arco aórtico; por contraste, cílios estão ausentes ou quase ausentes em regiões de artérias onde a tensão de cisalhamento é laminar. A maioria dos outros tipos celulares expressa PrC durante o desenvolvimento, sob certas condições de cultura celular, e em adultos. Dependendo do tipo celular, o PrC participa na especificação da assimetria do embrião, disposição do centrilo, regulação da proliferação/ciclo celular, autofagia, mecanotransdução com sensor de fluxo, quimiocultura, compartimentação e tráfico de proteínas de sinalização entre o citoplasma, citoplasma e nucleoplasma (por exemplo, para Gli e PDGFRα) . Quando presentes, os cílios são mais abundantes em células não proliferantes, com a extremidade proximal ancorada em uma invaginação do plasmalemma (bolsa ciliar) em ECs e outros tipos de células, mas não todos. Os cílios primários são complexados com o centrículo mãe do corpo basal que se liga ao centro microtubular-organizador (MTOC). A desmontagem/resorção do cílio durante a fase S e a liberação do centriólo são essenciais para a divisão celular . Como os PrC estão ligados ao citoesqueleto através do MTOC, a flexão ciliar induzida pelo fluxo nos ECs é capaz de ser transmitida através da célula, inclusive às junções célula-célula e célula matriz. Cílios primários transduzem tensão de cisalhamento fluido em células epiteliais tubulares renais e CEs através de um caminho que é excepcionalmente sensível à tensão de cisalhamento e envolve polistina-1 e polistina-2, que são codificadas por Pkd1 e Pkd2 . A polistina-1 tem propriedades mecanosensíveis enquanto a polistina-2 é um canal de cálcio TRP. Ambas as proteínas são necessárias para sentir a tensão de cisalhamento e, por sua vez, liberam óxido nítrico. Defeitos na PrC estão associados a muitas anormalidades. Por exemplo, mutações de PKD1 e PKD2 são causais de doença renal policística autossômica dominante, com ECs renais e células tubulares de pacientes evidenciando respostas deficientes de cálcio e NO e aumento da proliferação .

Cílios primários estão ausentes nas CEs de veias umbilicais humanas mantidas sob estresse de cisalhamento laminar e quiescência proliferativa em cultura celular. Em veias umbilicais humanas menos de um por cento dos CEs têm cílios que se projetam para a luz, enquanto em uma fração maior os cílios são localizados intracelularmente. A aorta embrionária e os CEs cultivados a partir dela têm um único cílio que se projeta para o lúmen. Os cílios endoteliais estão presentes em regiões de alto cisalhamento durante o desenvolvimento embrionário, juntamente com a expressão do fator de transcrição sensível ao cisalhamento, KLF2, que transaciona eNOS e outros genes anti-inflamatórios e anti-proliferativos . Em regiões com tensão de cisalhamento baixa ou perturbada, o PrC é desmontado/ausente e a expressão de Klf2 e eNOS é abolida e reduzida, respectivamente . A expressão do Klf2 também é inibida em ECs não celíacos isolados de artérias embrionárias, e a remoção química do PrC de ECs em cultura tem um efeito semelhante, ou seja, a abolição da expressão do Klf2 . Curiosamente, em CEs de ratos ApoE-/- adultos, que têm disfunção endotelial mas não desenvolvem placas, cílios são expressos ectópicamente na artéria carótida comum apesar da presença de fluxo laminar, em comparação com ratos do tipo selvagem que são desprovidos de cílios . Os cílios foram perdidos quando o alto cisalhamento foi induzido através do implante de um gesso com restrição de fluxo ao redor do vaso. A fundição de carótidas comuns em ratos do tipo selvagem induziu ciliogênese apenas em regiões de tensão de cisalhamento baixa e perturbada. Estes achados sugerem que a expressão do PrC em CEs in vivo em adultos é limitada a regiões de tensão de cisalhamento baixa/distúrbio, mas pode ocorrer ectopicamente em artérias com fluxo laminar na presença de disfunção endotelial causada por hiperlipidemia e possivelmente outros fatores de risco vascular. De nota, em áreas altamente ciliadas, de fluxo perturbado, como a curvatura interna do arco aórtico ou a jusante das placas, aproximadamente 25% das ECs têm um único cório, enquanto as demais são desprovidas, uma porcentagem semelhante ao que observamos nas arteríolas e colaterais.

Nossos achados de que PrC também estão presentes em arteríolas e colaterais em ratos adultos jovens saudáveis ressaltam a necessidade de estudos examinando a função ciliar nestes tipos de vasos. Isto inclui determinar se a nossa observação de menos cílios nas colaterais ECs do que nas arteríolas tem significado funcional. Células endoteliais são acopladas mecanicamente, eletricamente e difusivamente a ECs e SMCs adjacentes, assim apenas uma fração de ECs pode precisar expressar cílios para a transdução de sinais mecano-sensíveis ou outros sinais. Alta tensão de cisalhamento causa a desmontagem de cílios em ECs cultivados, enquanto a inversão de fluxo oscilatório induz a sua expressão. Especulamos que cílios em arteríolas e Cílios colaterais podem refletir o menor fluxo/ tensão de cisalhamento em arteríolas e fluxo muito baixo e perturbado em colaterais e que menos PrC em Cílios colaterais podem servir para reduzir sua sensibilidade ao ambiente de tensão de cisalhamento perturbado prevalente. Em outras palavras, menos cílios em colaterais podem fazer parte de um repertório de adaptações que se equilibram contra ou se opõem – através da manutenção ou aumento da expressão de KLF2/4, eNOS, e outros fatores anti-inflamatórios/anti-proliferativos – sinais inflamatórios, oxidativos, proliferativos, e apoptóticos de baixo grau, promovidos pelo ambiente hemodinâmico perturbado presente nas colaterais (Figura 9). Egorova et al. propuseram algo semelhante, ou seja, que como a presença de PrC em CE está associada à expressão de KLF2, cílios endoteliais podem sinalizar um freio na ativação de CE em regiões de fluxo baixo e perturbado. Um papel protetor para cílios nessas regiões é apoiado pelo recente relato de que a remoção de cílios endoteliais usando deleção condicional de Ift88 aumentou a aterosclerose e a expressão do gene inflamatório, e diminuiu a atividade da eNOS em ratos Apoe-/- alimentados com uma dieta rica em gordura, e que o endotélio se torna sensibilizado em regiões com tendência a apresentar diferenciação osteogênica em ratos Tg737 (orpk/orpk) ciliados defeituosos. Também é possível que, se os PrC forem protetores, menos colaterais possam contribuir para a alta suscetibilidade desses vasos à rarefação por envelhecimento e outros fatores de risco vascular. No entanto, menos cílios em colaterais poderiam simplesmente refletir um efeito secundário ou espectador, sendo uma consequência, por exemplo, de uma maior taxa de proliferação inerente de colaterais CE como evidenciado pelo aumento progressivo da tortuosidade colateral (discutido abaixo), já que acredita-se que a presença do PrC e sua associação com o corpo basal favorecem a remoção de células do ciclo celular. Estudos futuros serão necessários para determinar se nosso achado de cílios múltiplos em CEs reflete CEs que sofreram senescência proliferativa e citoquinesia falida associada e poliploidia nuclear.

Foi recentemente demonstrado que os CEs na retina de camundongo em desenvolvimento dependem do PrC para estabilizar as conexões dos vasos durante a remodelação do plexo vascular em regiões com tensão de cisalhamento baixa a intermediária . O fluxo de sentido de cílios endoteliais em embriões zebrafish, participam do recrutamento de células murais para vasos arteriais fatigados, e são necessários para a morfogênese vascular normal. O número e o diâmetro das colaterais diminui a partir da meia-idade . Esta rarefação induzida pela idade é fortemente acelerada por deficiência de eNOS/NO genética ou farmacologicamente induzida ou pela presença de fatores de risco vascular . O aumento do cisalhamento induz um remodelamento colateral para fora após uma obstrução arterial aguda ou em desenvolvimento lento . Pkd1+/- ratos e pacientes com doença renal policística autossômica dominante têm disfunção eNOS/NO endotelial . Será importante examinar em estudos futuros se o PrC colateral participa de uma ou mais das funções acima usando knockdown específico para CE da polistina-1, uma vez que: 1) deficiência na mesma leva à alteração da função ciliar, 2) a policistina-1 juntamente com a policistina-2 participam da detecção de fluxo pelo PrC, 3) formas mutantes de qualquer uma das proteínas causam doença renal policística , 4) há evidências de que a BVS, independentemente do seu papel na degradação da Hif1α, juntamente com GSK3β são necessários para a manutenção estrutural do cório, e 5) a proteína Rabep2, que é necessária para a colaterogênese, é um novo substrato de GSK3β , localiza-se no complexo cório-basal do corpo, e derrubá-lo leva a ciliogênese defeituosa. Outras abordagens para interferir com a presença e função ciliar, por exemplo, com a derrubada de outras proteínas ciliares, como Pkd2 e Ift88, também precisarão ser examinadas.

Em contraste com as arteríolas distais, que têm SMCs esparsas e descontínuas em vários tecidos incluindo a retina (não conseguimos identificar estudos no cérebro) , as SMCs eram contínuas em colaterais. Especulamos que isto pode ser um aumento adaptativo na espessura da parede para equilibrar o aumento da tensão da parede circunferencial causada pela conversão da energia cinética do fluxo em energia potencial aumentada (pressão transmural) como consequência da convergência de fluxo nas colaterais. Seria interessante examinar se a composição e a quantidade de matriz extracelular, que poderia ajudar os PMCs a equilibrar o aumento da tensão da parede em colaterais, difere em colaterais versus arteríolas. De notar que, apesar da sua maior cobertura das LMC, as colaterais têm menos tónus do que mais do que arteríolas de tamanho semelhante, e carecem de resposta miogénica – características únicas adicionais dos vasos colaterais .

O ambiente hemodinâmico perturbado, pró-oxidativo em que residem as células murais colaterais levou-nos a examinar se a expressão dos genes envolvidos na inflamação, proliferação celular, envelhecimento e angiogénese diferem para as colaterais versus arteríolas distais. Colaterais mostraram níveis aumentados de mRNAm para o gene pró-inflamatório, pró-apoptose inflammática, Pycard, os genes pró-proliferativos, Ki67, Pdgfb, e Angpt2, o gene anti-proliferativo, Dll4, e o gene marcador de CE do tipo arterial diferenciado, Ephrinb2. Entretanto, a expressão dos genes inibidores do ciclo celular, p21, p27 e p53, não foram diferentes, nem outros genes associados com proliferação, parada do ciclo celular e envelhecimento (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomerase). Também não houve diferenças na expressão de outros genes associados à proliferação da CE e/ou da CMB (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) e que são necessários (no caso dos três primeiros genes ) para formação de colaterais durante o desenvolvimento ou envolvidos na especificação da CE e da CMB diferenciação e quiescência (Tgfb, Angpt1). O aumento da expressão pelos colaterais dos genes pró-proliferação acima é consistente com nossas medidas de tortuosidade, que sugerem que células murais colaterais têm uma maior taxa de proliferação, em comparação com outros vasos arteriais: a tortuosidade colateral era evidente no primeiro dia após o nascimento, continuou a aumentar até a meia idade, e depois diminuiu. Esta última ocorreu ao mesmo tempo em que as colaterais apresentam um declínio em número e diâmetro com o envelhecimento avançado. Estes achados apoiam a hipótese de que a rarefação das colaterais associadas à idade é causada pela senescência proliferativa e subsequente apoptose das colaterais CE e SMC devido a uma elevação da taxa de proliferação ao longo da vida causada pelo ambiente hemodinâmico perturbado e de baixo conteúdo de oxigênio no sangue em que as colaterais residem (Figura 9).

Colaterais também mostraram aumento da atividade da eNOS, que estudos anteriores mostraram rarefação oposta das colaterais causadas pelo envelhecimento e outros fatores de risco vascular . o NO derivado da eNOS inibe o estresse oxidativo, inflamação, proliferação, adesão de leucócitos, agregação plaquetária e envelhecimento celular e promove o relaxamento da SMC . Como o shear stress é um estímulo próximo ao NO derivado da eNOS, o aumento da eNOS/NO em colaterais com seu ambiente de estresse de cisalhamento baixo e perturbado pode diminuir o efeito dos fatores que promovem a rarefação colateral (Figura 9). Da mesma forma, a expressão mantida dos fatores de transcrição sensíveis ao cisalhamento de EC, Klf2 e Klf4, em colaterais apesar de seu baixo e oscilatório fluxo, que inibe a expressão desses fatores em outras partes da vasculatura arterial com fluxo perturbado, pode atuar como fatores adicionais de “balanceamento” ou especializações colaterais, juntamente com aumento da eNOS, EC alinhada, menos cílios, cobertura robusta de SMC e aumento da ephrin-B2 e Dll4. A expressão de KLF2 e KLF4, que regulam negativamente a proliferação, inflamação e angiogênese, upregulam a eNOS, e são fortemente desregulamentados em locais de tensão de cisalhamento baixa e perturbada, não foram diferentes em colaterais versus DMAs. Curiosamente, o PrC promove a expressão Klf2, Klf4 e eNOS .

A limitação dos estudos acima é que o RNA foi obtido de vasos dissecados, que são compostos de ECs, SMCs, e, embora menos, pericíticos, fibroblastos e células mielóides residentes. São necessários estudos que utilizem a separação dos tipos celulares e o exame de uma gama mais ampla de genes e seus respectivos níveis protéicos. Entretanto, a dificuldade em dissecar manualmente colaterais e arteríolas distais nos números necessários, o efeito das técnicas de dissociação celular sobre os níveis basais de RNA e proteína, a ausência de modelos de cultura celular de ECs e SMCs “colaterais”, e a ainda falta de qualquer gene marcador específico colateral, impossibilitam o uso dessas abordagens. De nota, no entanto, a expressão de vários dos genes examinados são específicos ou enriquecidos para os CEs, por exemplo, Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2, e Klf4. Entretanto, a análise da transcrição gênica nem sempre reflete mudanças no nível ou função da proteína; assim, a investigação de marcadores de estresse oxidativo, inflamatório, proliferação ou senescência ao nível da proteína pode refletir melhor as diferenças nas características celulares.