A amplificação de MYC diminui a sobrevivência através de múltiplas malignidades humanas

Uma das principais TFs que regulam a proliferação de células de mamíferos é a oncoproteína viral mielocitomatosa (MYC), cuja função é conservada através de hierarquias evolutivas27,28,29,30,31. Fisiologicamente, a proliferação regulada pela MYC é sucedida por programas de diferenciação de linhagem que antagonizam a MYC para acabar com a proliferação20. Analisamos as alterações MYC por duas abordagens. Primeiro, analisamos as alterações do número de cópias (CN) no locus MYC usando dados TCGA e ICGC disponíveis através da plataforma cBioPortal e encontramos freqüentes amplificações e ganhos de MYC (Fig. 1a). Em seguida, acessamos dados do TCGA pan-cancer (PANCAN) contendo 11.000 pacientes em 33 dos tumores mais prevalentes e os analisamos através do navegador Xena. O MYC foi altamente amplificado através destas neoplasias malignas8,10. Em ambos os conjuntos de dados, as alterações do MYC CN foram determinadas usando o método GISTIC score, onde valores de -2,-1,0,1,2, representaram deleção homozigótica, heterozigótica, diplóide, amplificação de baixo nível ou amplificação de alto nível32. Em seguida, realizamos a análise de sobrevivência usando escores GISTIC prevendo deleção de baixo nível/depósito MYC, vs. ganho/amplificação usando o conjunto de dados PANCAN. A amplificação MYC correlacionou com diminuição da sobrevivência geral (p < 9,784 × 10-11, n = 2628) em comparação com casos com MYC CN WT/eliminações de baixo nível (n = 1352) (Fig. 1b). Em seguida, analisamos a correlação entre os escores GISTIC no locus MYC vs. MYC mRNA expressão e sobrevida do paciente. Houve uma forte correlação (spearman r = 0,3339, p < 0,0001, n = 9697) entre o escore MYC GISTIC e a expressão MYC mRNA (Fig. 1c). Alto (n = 1762) vs. baixo n = 1776) níveis de mYC mRNA foram associados com diminuição (p < 5,609 × 10-8) sobrevivência global (Fig. 1d). Assim, o MYC é um oncogene vital em muitas malignidades humanas e a identificação de mecanismos para antagonizar o MYC no câncer poderia ter aplicações terapêuticas. A função MYC é conservada através de hierarquias evolutivas27,28,29,30,31. O ciclo de vida simples dos protozoários requer que a MYC gere células filhas que se assemelhem às células parentais com cada divisão celular27,29. A evolução de um único organismo celular para organismos multicelulares levou ao uso intenso de energia para abrir a cromatina e expor o DNA nu, permitindo que as TFs da linhagem se liguem e ativem centenas de genes de diferenciação terminal que guiam o destino e a especialização celular em várias camadas de células. Este processo não requer a proliferação ativa das células. Portanto, a proliferação mediada por MYC é potencialmente antagonizada nesta fase33,34 (Fig. 1e). Esta forma de antagonismo potente da MYC também é necessária para a existência de multicelularidade29,35. Convincentemente, a infecção de organismos multicelulares com protozoários parasitas aumenta a transformação de células infectadas em células proliferativas por mecanismos complexos que ativam a proteína MYC e suprimem a diferenciação TFs27,29,36,

Células normais não semelhantes, as células malignas sofrem proliferação sem diferenciação terminal (Fig. 1e, f). Este processo aberrante é fortemente dependente da estabilização da MYC e suas co-proteínas que modulam o crescimento e divisão celular17,20,37,38,39. Alterações genéticas e epigenéticas asseguram que a proliferação persistente de progenitores comprometidos de linhagem ocorre sem diferenciação final nas células cancerígenas (Fig. 1e)7. Primeiro, a proliferação persistente é alcançada pela upregulação consistente e ganhos cromossômicos do locus genético que codifica o gene MYC através de malignidades humanas (Fig. 1a). A amplificação MYC prevê baixa sobrevivência geral (LogRank p-valor = 9,784 × 10-11, n = 3980) (Fig. 1a, b). Em estudos usando modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMM) ou modelos xenograft de câncer, a antagonização da MYC sustenta a regressão tumoral através de múltiplos tumores39,40,41. Por exemplo, Shachaf et al. desenvolveram um modelo de camundongo transgênico expressando condicionalmente a MYC em hepatócitos usando expressão controlada por tetraciclina39. A inativação da regressão induzida pela Myc do CHC murino aumentando a diferenciação de hepatócitos e células hepatobiliares, perda do marcador de CHC α-fetoproteína, e supressão da proliferação39. Num modelo PDAC de xenoenxerto, Zhang et al. visaram a dimerização do MYC-MAX com uma pequena molécula (10058-F4) que perturba a actividade transcripcional do MYC40. A adição do 10058-F4 à gemcitabina levou a uma atenuação drástica da tumorigenese em comparação ao tratamento com um único agente40. Usando um modelo de câncer de pulmão conduzido por Kras, Soucek et al. visaram a MYC usando um domínio dominante de dimerização negativa de MYC mutante, interrompendo a ligação da MYC ao elemento de resposta canônica Myc E-box ‘CACGTG’, inibindo assim a atividade de transação de MYC41. A inibição da transplantação de MYC aumentou a sobrevivência de ratos ao terminar com o crescimento do câncer de pulmão41.

De uma perspectiva translacional, existem vários desafios na tentativa de atingir diretamente a farmacologia MYC42. O desafio mais importante é que a proliferação é uma característica dos progenitores normais e tal terapia poderia ter um índice terapêutico pobre20. Além disso, os tumores têm origens genéticas heterogéneas, contribuindo para a actividade sustentada da MYC. Portanto, para compreender os mecanismos que antagonizam as ações excessivas de MYC, é imperativo definir os métodos fisiológicos evolutivos conservados pelos quais os progenitores normais antagonizam a MYC para impedir a proliferação intensa e como estes podem ser restaurados no câncer.

Proliferação terminante por apoptose é tóxica para as células normais divididas

Para reter a coesão e integridade entre diferentes tipos celulares, os organismos multicelulares desenvolveram um sistema de controle e equilíbrio coletivamente conhecido como apoptose43,44. O TF mestre da apoptose p53 (TP53) e seu cofactor p16 ou p14ARF (CDKN2A) desempenham papéis cruciais ao deter células em proliferação para permitir a reparação de danos, ou ao iniciar o suicídio ordeiro se tais danos não puderem ser reparados45,46. Durante a embriogênese, a expressão da p53 é desregulada talvez porque as células-tronco embrionárias se auto-renovam sem proliferar exponencialmente47,48,49. Estudos funcionais de expressão diferencial da p53 utilizando ensaios de repórter demonstraram maior expressão em estágios posteriores de desenvolvimento, e diminuição da expressão em células terminalmente diferenciadas48. Durante a divisão celular, as vias da p53 antagonizam potentemente as vias da MYC para deter a proliferação, permitindo que as células comprometidas sejam reparadas; células irreparáveis sofrem autodestruição através de apoptose irreversível para proteger a integridade de todo o organismo43. Como os ratos p53-knockout (KO) têm desenvolvimento normal e não são aumentados50, isto ilustra que as vias de apoptose não são os mecanismos dominantes usados pelos geradores de linhagem para acabar com a proliferação exponencial. Assim, camundongos exibindo KO duplo de Trp53, e homólogos fosfatase e tensina (Pten) desenvolvem tumores glioma por não antagonizarem MYC, mas este fenótipo só é observado nos duplos nocauteados de Trp53 e Pten45,46. No PDAC, a mutação genética mais frequente é o KRAS (~92%). GEMMs nos quais o KRAS mutante (ratos KC) é expresso em células do pâncreas desenvolvem PDAC em 30 a 40% dos casos aos ~8-12 meses de idade51. A adição de Trp53 mutante ao GEMM acima (ratos KPC) aumenta a penetração do PDAC e diminui a sobrevivência para ~5 meses, enquanto ratos KC com deleção de Ink4a sobrevivem por ~2-3 meses52,53. Ratos com Trp53 mutante sozinhos sem Kras mutante não desenvolvem o PDAC53. Em contraste, em modelos de camundongos com câncer de ovário foi demonstrado que a inativação do Trp53 resulta em tumores invasivos, mas o desenvolvimento tumoral é acelerado em camundongos com inativação concomitante de Brca1 e Trp5354.

TP53 e CDKN2A são freqüentemente inativados bi-alelelamente através de malignidades humanas (Fig. 2a). Tal inativação tem grande impacto no tratamento7. Para acabar com a proliferação maligna, a quimioterapêutica convencional visa upregular o p53/p16, induzindo estresse citotóxico que imita os ativadores fisiológicos desta via55. Uma vez que células malignas e células normais coexistem dentro do mesmo meio, tal tratamento tem um índice terapêutico desfavorável, uma vez que estes genes são mutantes/fisicamente indisponíveis em células malignas, mas intactos em células normais. Foram investigados múltiplos métodos para reencetar a apoptose na terapia do câncer, mas tem sido difícil abordar esta questão fundamental do índice terapêutico56. Os avanços nas técnicas genómicas indicam que quando os genes TP53/CDKN2A são do tipo selvagem, como no cancro testicular, o tratamento com quimioterapia citotóxica (por exemplo, cisplatina) produz respostas completas que aumentam a sobrevivência global e livre de doenças57 (Fig. 2a, b). As malignidades com altas taxas de inativação do TP53/CDKN2A não apresentam essas respostas levando a resistência a múltiplos tratamentos baseados em apoptose (quimio-resistência ampla e radio-resistência) (Fig. 2a, b, e, f)7. Mesmo diferentes tipos de tumor originários do mesmo órgão têm melhores respostas ao tratamento se os genes da apoptose estiverem intactos. Por exemplo, as mutações TP53 e CDKN2A ocorrem em ~70 e 90% do PDAC, respectivamente58 (Fig. 2a). A taxa de sobrevivência global de 5 anos no PDAC é de ~9% mesmo quando se incluem pacientes tratados com quimioterapia ou terapias combinadas e/ou cirurgia59,60. Em contraste, os tumores neuroendócrinos pancreáticos (PNETs), geralmente não abrigam mutações TP53, apresentam apenas deleções mínimas de CDKN2A61, e têm uma taxa de sobrevida de 5 anos >50% quando tratados com terapia indutora de apoptose62. Similarmente, o glioblastoma multiforme (GBM) exibe uma variedade de características clínicas, histopatológicas e moleculares, e abrigam mutações TP53 em ~30% dos casos primários e ~65% dos GBM63,64. As células do glioma com WT TP53 são sensíveis ao estresse citotóxico induzido por agentes quimioterápicos clinicamente disponíveis, em comparação com aquelas com o mutante mutante transcriptionally silenciado TP5365,66,67. Adicionalmente, no modelo de rato induzido Trp53 do PDAC (KPC), a inactivação genética de um alelo de Myc sensibiliza a resposta terapêutica gemcitabina40. Portanto, analisamos dados genômicos comparando as dez malignidades superiores com uma freqüência elevada de alterações TP53/CDKN2A (TP53/CDKN2A-alta) com as dez malignidades inferiores com alterações TP53/CDKN2A de baixa freqüência (TP53/CDKN2A-baixo) (Fig. 2b, c). Verificamos que 7/10 dos cancros TP53/CDKN2A-altos tiveram uma diminuição na sobrevida global e livre de doenças quando estes genes sofreram mutações (Fig. 2b; Tabela S1) (valores de p < 0,05). Consistentemente, mesmo nos casos TP53/CDKN2A-baixo, houve uma diminuição na sobrevida global e livre de doença quando estes genes foram alterados (valores de p < 0,05) (Fig. 2c; Tabela S1). Assim, a taxa de alterações nos genes da apoptose é menor em neoplasias malignas curáveis (câncer de testículo/ TODOS pediátricos) em comparação com cânceres altamente refratários/resistentes ao tratamento (PDAC/HCC) (Fig. 2g). Durante a maturação fisiológica, o WT TP53 induz apoptose irreversível de células insalubres para reter a integridade de todo o organismo (Fig. 2h). Por outro lado, a evolução oncogênica mutua os mediadores da apoptose levando à resistência à indução da apoptose (Fig. 2h).

Alterações genéticas e epigenéticas dos genes de diferenciação no câncer

As neoplasias malignas humanas mais agressivas são pouco diferenciadas13. Embora a diferenciação contribua para a má sobrevivência em múltiplas malignidades humanas, os mecanismos que sustentam o impedimento da diferenciação em células malignas são, na maioria das vezes, pouco claros, mas novos conhecimentos estão surgindo5,6,7. Identificamos as principais linhagens mestras TFs para o desenvolvimento do ovário, pâncreas e fígado usando estudos publicados de conversão de linhagem, ou estudos com modelos transgênicos de camundongos6,68,69,70,71,72,73,74 (Tabela 1). Os programas de diferenciação celular e comprometimento de linhagem são ditados por este punhado de TFs mestres e seus co-fatores. Embora múltiplos cofatores tenham papéis importantes, os mais vitais são os coactivadores transcripcionais e os corepressores que usam ATP para remodelar a cromatina para ligar ou desligar os genes alvo33,34,75. Assim, analisamos as alterações genéticas nas TFs de linhagem, seus coactivadores e corepressores em OVC, PDAC e HCC (Tabela 1).

As células malignas não podem suprimir completamente a diferenciação, pois é um continuum ao longo do qual todas as células existem, as TFs mestres que especificam comprometimento em várias linhagens quase nunca são completamente inativadas pela mutação, mas são frequentemente haploinsuficientes (Fig. 3a; Tabela 1). Esta redução de dose-redução é suficiente para parar os avanços ao longo do contínuo de diferenciação em seus pontos mais proliferativos5,6,7. Por exemplo, a perda FOXL1 foi freqüente na COV (Fig. 3a), e a freqüência da perda FOXL1 foi maior na COV mal diferenciada (Fig. 3b). Este padrão foi semelhante para o GATA4 no PDAC e CHC, embora estas neoplasias malignas tivessem um pequeno número de pacientes sobrevivendo além dos estágios I e II (Fig. 3b, c). Identificamos parceiros-chave que são co-ativadores e corepressores de várias TFs de linhagem específica (Tabela 1) por análise da literatura e dados depositados no banco de dados UniProt (http://www.uniprot.org/). Para aumentar a diferenciação estagnada, os coactivadores foram encontrados frequentemente inactivados e apagados (Tabela 1; Fig. 4a) favorecendo a repressão dos genes a jusante visados pelas TFs chave. Novas linhas de evidência implicam agora que tais alterações prejudicam os caminhos que medeiam a diferenciação terminal6,7,76. As primeiras descobertas das funções destas enzimas coactivadoras demonstraram que o seu papel na fisiologia era o de utilizar ATP para mobilizar as interacções do ADN histórico de tal forma que o ADN nu fosse exposto, permitindo assim que as TFs se ligassem e activassem os genes alvo33,34,75,77. Este processo é conservado em evolução desde a levedura78, um dos mais simples metazoários, até os homo-sapiens77. A inativação destes genes no câncer poderia ser uma tentativa de prejudicar a capacidade dos coactivadores de expor o DNA para dominar as TFs que ativam os genes a jusante. Uma grande pista para esta hipótese é que as TFs mestres da linhagem são seletivas no uso de coactivadores específicos para mediar a ativação dos genes da linhagem (Tabela 1). Outra pista é que células malignas tendem a perder um alelo de linhagem especificando TFs, um evento que pode ser suficiente para permitir o comprometimento da linhagem mas insuficiente para diferenciação terminal6,7 (Fig. 3a; Tabela 1). Por exemplo, os progenitores hepáticos requerem cooperação entre GATA4 e FOXA1 para recrutar coactivadores (por exemplo, ARID1A) e mediar a activação dos genes de diferenciação hepática. No CHC, a perda heterozigótica do GATA4 é freqüente (68%, n = 366, Fig. 3a; Tabela 1) e as mutações inativadoras no ARID1A são comuns (44%, n = 366, Fig. 4a; Tabela 1)6. A diferenciação hepática é prejudicada e a proliferação aumentada nos fígados com Gata4 ou Arid1a haploinsuficiência hepática condicional6,76,79. Além disso, a reintrodução do GATA4 no GATA4 com deficiência de HCC, ou ARID1A no ARID1A mutante mas GATA4 intacto, ativa centenas de genes de diferenciação epitelial hepatocitária6. Os TFs mestres da linhagem pancreática incluem o GATA4 e o GATA680,81. As perdas de número de cópias de um alelo destes fatores são observadas no PDAC, com perda de mutações funcionais em coactivadores também observadas (Tabela 1; Figs. 3a, 4a). Entretanto, os PDACs também exibiram uma alta incidência de amplificação ou ganho de GATA4 e GATA6, sugerindo que em certos casos essas TFs podem conferir uma vantagem de crescimento às células cancerosas pancreáticas. Na COV, um alelo de TFs mestre ovariano FOXL182,83 é frequentemente perdido (80%, Fig. 3a; Tabela 1 n = 316), enquanto os coactivadores, como ARID3A e ARID3B, são frequentemente inactivados (Tabela 1; Fig. 4a). Assim, no núcleo da transformação maligna, o impedimento de diferenciação aumenta rotineiramente a proliferação maligna e é alcançado através da haploinsuficiência de TFs mestre e inativação dos coativadores que eles usam. Este entendimento pode levar a tratamentos que visem o reencaminhamento da diferenciação, como alternativa à apoptose, como meio de acabar com a proliferação maligna.

Enzimas corepressoras: alvos emergentes para oncoterapia de restauração da diferenciação

Um enhanceosoma é composto de complexos multiproteicos que cooperam para ativar genes de uma determinada linhagem84,85, por exemplo, os enhanceossomas hepáticos activam os genes hepatocitários6, enquanto os enhanceossomas pancreáticos e ovarianos activam os genes pancreáticos86 e ovarianos87 , respectivamente. A ruptura genética dessa cooperação pode deslocar o conteúdo desses núcleos proteicos dos coactivadores para os corepressores que reprimem os genes da linhagem, em vez disso76,88,89. Tal repressão é ainda possibilitada pelo status inerente de cromatina fechada dos genes de diferenciação terminal, contrastando com a cromatina inerentemente aberta na proliferação e genes de diferenciação precoce6,7,90.

Para que a proliferação exponencial ocorra desacoplada da diferenciação dianteira, um alto grau de atividade do núcleopressor é necessário para o silenciamento epigenético dos genes de diferenciação da linhagem. Consequentemente, a atividade aberrante do núcleopressor é freqüentemente observada em células malignas, onde centenas de genes de diferenciação terminal têm acúmulo de núcleospressores ativos6,89. Ao contrário dos coactivadores, que são frequentemente inactivados por mutações/deleções genéticas6, os corepressores são frequentemente do tipo selvagem ou amplificados em células malignas (Tabela 1; Fig. 4b). A enzima DNA metiltransferase 1 (DNMT1) é um corepressor para a TF mestre e também a metiltransferase de manutenção que recapitula a metiltransferase CpG na cadeia de DNA recentemente sintetizada à medida que as células passam por ciclos de divisão91,92,93. Nos dados do TCGA PANCAN, níveis elevados de DNMT1 estão associados a baixa sobrevivência (p < 0,00001, n = 5145), em comparação com casos com níveis baixos de DNMT1 (n = 5199) (Fig. 5a). Isto sugere um papel importante desta enzima em numerosos cancros humanos. Portanto, vários estudos têm evoluído na última década, tentando desenvolver intervenções terapêuticas visando o DNMT1 na terapia do câncer94,95,96,97,98,99,100,101,102. Da mesma forma, a ubiquitina, contendo domínios de PHD e dedos RING, 1, (UHRF1), coopera estreitamente com o DNMT1 na regulação da metilação do DNA103,104. Analisamos os níveis de expressão de UHRF1 no conjunto de dados PANCAN e constatamos que níveis altos de expressão de UHRF1 (p < 0,0001, n = 5150) previam fortemente baixas taxas de sobrevivência em comparação com níveis baixos (n = 5189) (Fig. 5b), ilustrando a importância desses genes de metilação em cancros humanos.

DNMT1-depletion sem citotoxicidade tem benefícios terapêuticos mesmo na síndrome mielodisplásica (MDS) e na leucemia mielóide aguda (LMA) contendo defeitos do sistema p53102,105, e múltiplos ensaios clínicos estão em curso para avaliar mais amplamente o DNMT1-depletion na terapia do cancro (embora a decitabina e a 5-azacytidina utilizadas para esgotar o DNMT1 tenham limitações farmacológicas que podem minar a sua capacidade de esgotar o DNMT1 de tumores sólidos) (Tabela 2). Na leucemia promielocítica aguda (APL), remissões completas são obtidas pela combinação de arsênico com ácido retinóico para inibir os principais compressores recrutados na proteína de fusão da leucemia PML-RARA106,107. Como os co-repressores não sofrem mutação e têm atividade aberrante no câncer, são alvos moleculares lógicos e suficientes que podem envolver genes de diferenciação terminal para saídas do ciclo celular p537,89,99,100,102,105,108,109,110,111 (Tabela 2; Fig. 5c, d).

Vários outros corepressores também foram investigados como alvos moleculares potenciais para a terapia epigenética do câncer. Por exemplo, as enzimas histone deacetylase (HDAC) são os principais corepressores recrutados em centros TF de muitas malignidades humanas e são conhecidos como supressores epigenéticos de expressão gênica5,6,88,89. Em muitos estudos pré-clínicos, as enzimas HDAC têm sido investigadas como potenciais indutores de diferenciação celular94,95. Um problema com o direcionamento dos HDACs, no entanto, é sua função celular pleiotrópica – mesmo a atividade no alvo pode, portanto, produzir efeitos colaterais não intencionais. Outros corepressores comuns upregulados em muitas malignidades humanas são enzimas de lisina desmetilase, como o KDM1A (Fig. 4b). Vários estudos têm demonstrado indução de diferenciação por alvos farmacológicos do KDM1A e estudos clínicos relacionados estão atualmente em andamento112.113.114.115.116. Utilizando uma tela in vivo pan-cancer de alta produtividade, Carugo et al. demonstraram recentemente uma ligação entre o corepressor WDR5 e a proliferação mediada pelo MYC do PDAC117. A interrupção do WDR5 através de ensaios de inibição levou à progressão do tumor e ao aumento da sobrevida em modelos de PDX de camundongos PDAC117. Nesta revisão sistemática, temos documentado outros compressores principais recrutados para os centros mestres da TF de muitas malignidades humanas que requerem validação genética e farmacológica adicional como alvos moleculares candidatos que aumentam a diferenciação. Estes incluem HES1, BAZ1A/B, BAZ2A, EED, SUZ12 e UHRF1 (Figs. 4b, 5b; Tabela 1). Além disso, foi encontrada uma upregulação desses núcleospressores ligada a estágios clínicos patológicos avançados sugerindo efeito direto na supressão da diferenciação. Por exemplo, o HES1 foi encontrado como o mais frequentemente upregulado no COV (Fig. 4b), e os estágios III e IV do COV tiveram maiores ganhos de HES1 em relação aos estágios I e II (Fig. 4c). Assim, a terapia de inibição do HES1 pode ser vital para a terapia de diferenciação da COV. Este padrão também foi observado para BAZ1B no PDAC e KDM1B no CHC (Fig. 4b, d, e). Estas observações sugerem que, nestas neoplasias malignas, o direcionamento destas enzimas chave para a indução de diferenciação poderia proporcionar estratégias terapêuticas adicionais que contornem os defeitos do sistema p53.