Abstract
A derivação de um modelo quantitativo do metabolismo da fenilalanina em humanos é descrita. O modelo é baseado nas propriedades cinéticas da fenilalanina hidroxilase humana recombinante pura e em estimativas das taxas in vivo de transaminação da fenilalanina e degradação da proteína. Os valores calculados para a concentração em estado estacionário da fenilalanina no sangue, a taxa de depuração da fenilalanina do sangue após uma carga oral do aminoácido, e a tolerância dietética da fenilalanina concordam bem com os dados de pacientes normais, bem como de pacientes fenilcetonúricos e obrigam a heterozigotos. Estes valores calculados podem ajudar na decisão sobre o grau de restrição da ingestão de fenilalanina necessário para alcançar um resultado clínico satisfatório em pacientes clássicos e naqueles com formas mais leves da doença.
O passo inicial e limitador de taxa no catabolismo completo da fenilalanina ao CO2 e à água é a sua hidroxilação à tirosina, uma reação catalisada pelo sistema de hidroxilação da fenilalanina. O sistema é complexo, consistindo de fenilalanina hidroxilase (PAH), a coenzima pterina tetrahidrobiopterina (BH4), e várias enzimas que servem para regenerar a BH4, ou seja dihidropteridina redutase e pterina 4α-carbinolamina desidratase (1, 2).
Embora o anel de benzeno da fenilalanina não possa ser rompido sem antes ser hidroxilado na posição para, a cadeia lateral de alanina do aminoácido pode ser metabolizada mesmo na ausência da etapa de hidroxilação do anel. Esta via alternativa é iniciada pela transaminação da fenilalanina para fenilpiruvato seguido pela conversão deste último composto em metabólitos como o fenilactato, fenilacetato e o-hidroxifenilacetato. Os produtos do caminho da transaminase são excretados na urina. Os passos nestas vias alternativas do metabolismo da fenilalanina estão delineados na Fig. 1.
No início, deve-se notar que uma tentativa anterior de realizar tal análise foi prejudicada pela falta de dados sobre as propriedades cinéticas da HAP humana e da transaminase de fenilalanina humana. De fato, para esta última enzima, mesmo a identidade do responsável por esta atividade in vivo não era conhecida com certeza. Como as evidências in vitro indicavam que a fenilalanina é um excelente substrato para a aminotransferase de aspartato mitocondrial, foi assumido que esta é a transaminase envolvida. Além disso, como as propriedades da contraparte humana não eram conhecidas, foram utilizadas as propriedades cinéticas da enzima de rato correspondente (12). A forma como o problema da transaminase humana foi tratado na presente análise será discutida abaixo.
As propriedades cinéticas da HAP humana recombinante estão agora disponíveis (16, 17). A cinética da HAP é algo complicada pelo fato de que a fenilalanina serve não apenas como substrato para a enzima, mas também como ativador (ver ref. 1 e referências nela). Como uma análise prévia do comportamento cinético da HAP baseada em um modelo de dois locais com ligação ordenada da fenilalanina tanto em um local catalítico quanto em um local regulatório poderia explicar adequadamente muitos aspectos peculiares do comportamento cinético da enzima (18), um modelo similar de ligação ordenada em dois locais foi utilizado na presente análise. A equação da taxa real utilizada (19) é mostrada em Eq. 2, onde Km é a concentração de fenilalanina que dá meia velocidade máxima e Ka é a concentração de fenilalanina que dá meia ativação máxima em um experimento no qual a HAP foi préincubada com concentrações variáveis de fenilalanina. Para a presente análise, foram utilizadas as seguintes constantes cinéticas, determinadas com HAP humana recombinante pura a 37°C, sendo a BH4 a coenzima: Km para a fenilalanina, 0,51 mM, e Ka para a fenilalanina como ativador, 0,54 mM (D. Kowlessur e S.K., dados não publicados). Um valor aproximado de Vmax para HAP humana (16) (provavelmente uma subestimação) foi calculado a partir da taxa inicial de diminuição dos níveis séricos de fenilalanina (0,9 μmol/ml por h) em indivíduos controle após terem recebido uma carga oral de l-fenilalanina suficiente para aumentar seus níveis séricos de fenilalanina em ≈17-por dobrar (20). 
2 Como indicado acima, o problema anterior da identidade da enzima no homem responsável pela transaminação da fenilalanina foi contornado na presente análise. Assumiu-se que a principal via para a eliminação líquida da fenilalanina em pacientes com PKU clássica é através da transaminação. Por exemplo, como já mencionado, a excreção urinária de fenilalanina é apenas ≈11% da quantidade que é transaminada e, ao final do primeiro ano de vida, pode-se estimar que a quantidade de fenilalanina descartada via incorporação à proteína é apenas de 5% da que é descartada via transaminação. Deve-se notar que com o presente método de estimativa da taxa de transaminase de fenilalanina, que se baseia na taxa de depuração da fenilalanina do sangue, reações menores para a disposição da fenilalanina, tais como sua excreção urinária e sua incorporação na proteína, são subsumidas na estimativa da atividade da transaminase, resultando em uma pequena superestimação desta atividade.
Para ser útil na presente análise, valores para o Km e Vmax da transaminase são necessários. Foram feitas tentativas para extrair um valor de Km para a transaminação com fenilalanina dos resultados dos testes de carga de fenilalanina realizados em pacientes com PKU clássica (21). A abordagem adotada para estimar um valor de Vmax para a enzima transaminase humana foi utilizar dados sobre a soma de todos os metabólitos derivados da transaminação (ou seja, fenilpiruvato, fenilactato e o-hidroxifenilacetato) excretados por um grupo de pacientes com PKU clássica em função dos seus níveis plasmáticos de fenilalanina. A quantidade máxima excretada, expressa em mmol/mol creatinina, foi de 1.370, um nível que apareceu em platô a níveis plasmáticos de fenilalanina entre 1.200 e 2.400 μmol/liter (22).
As tentativas de converter este valor em taxa de transaminação são complicadas pela ampla gama de idades, ≈2 anos a ≈18 anos, na amostra de pacientes utilizada no estudo. Para a presente análise, foi assumido que o peso corporal médio dos pacientes era de 50 kg e que a excreção diária de creatinina era de 2 g/24 h (23). Foi ainda assumido que a excreção de metabólitos derivados de transaminases ocorre a uma taxa linear durante o período de 24 horas e reflete a taxa de formação desses metabólitos. Também foi assumido que esses compostos se equilibram com todos os compartimentos de fluido corporal, exceto tecido conjuntivo de cartilagem densa e osso, que, juntos, representam 15% do total de água corporal (24), produzindo um volume de distribuição de água acessível de 500 ml/kg de peso corporal. Com base nestas hipóteses, a taxa máxima de transaminação foi calculada em 0,043 μmol/ml por h.
Um produto adicional do metabolismo da fenilalanina que é derivado, pelo menos em parte, do fenilpiruvato que não foi medido no estudo de Langenbeck et al. (22) é a fenilacetylglutamina (PAG). Há evidências de que o PAG pode ser formado a partir do fenilacetato, que é derivado do fenilpiruvato por descarboxilação oxidativa (25). Também tem sido proposto que o fenilalanina e, portanto, o PAG, pode ser formado a partir da fenilalanina por uma via que não envolve transaminação, mas envolve descarboxilação à feniletilamina seguida de oxidação da amina ao fenilacetato (26). O achado de que a quantidade de feniletilamina excretada em pacientes com PKU é pequena mesmo após a oxidação da amina ter sido bloqueada pela administração de um inibidor da amina oxidase (27), entretanto, indica que, como discutido anteriormente (12), a descarboxilação da fenilalanina é uma via quantitativamente menor para o metabolismo da fenilalanina, bem como para a formação da PAG.
A quantidade de PAG excretada por indivíduos normais é de 250-500 mg/dia; pacientes com PKU excretam o dobro dessa quantidade (28). Para fins de cálculo da quantidade de PAG formada através da via transaminase, a hipótese conservadora foi feita de que apenas a quantidade “extra” excretada pelos pacientes é derivada do fenilpiruvato. Tomando a quantidade extra média de PAG excretada como 350 mg/dia e fazendo as mesmas suposições descritas acima, esta excreção se traduz em uma taxa de formação de PAG de 0,020 μmol/ml por h, elevando a taxa de formação de todos os produtos transaminados para 0,063 μmol/ml por h.
Com o uso deste valor para Vmax, os resultados do teste de carga de fenilalanina realizado em pacientes com PKU clássica (21) foram usados para calcular um valor de 1.37 ± 0,14 mM (média ± DP, n = 3) para o Km de transaminase de fenilalanina.
Porque na presente análise, as atividades de HAP e transaminase são calculadas em função dos níveis sanguíneos de fenilalanina, é importante que esses níveis reflitam os níveis teciduais do aminoácido. Relevante para este ponto, os níveis de fenilalanina no tecido hepático de um paciente com PKU (29), bem como no tecido hepático e renal de ratos hiperfenilalanémicos (30), têm sido relatados como sendo comparáveis aos níveis correspondentes no sangue.
O terceiro termo em Eq. 2, a taxa de degradação da proteína líquida, foi estimado a partir dos dados de Waterlow e Jackson (31), mostrando que no estado de jejum, o estado sob o qual o teste de carga de fenilalanina é realizado, a decomposição da proteína líquida (ou seja a quantidade de proteína decomposta menos a quantidade sintetizada) é igual a 0,30 g/kg de peso corporal por 12 h. Como o músculo esquelético constitui ≈40% da massa corporal (24) e o catabolismo proteico neste tecido desempenha um papel importante no fornecimento de aminoácidos à periferia, a degradação proteica no músculo esquelético foi tomada como o evento predominante na degradação da proteína que ocorre durante o jejum.
Músculo esquelético humano contém ≈46 μmol fenilalanina/g tecido (32). Com base nesse valor e no achado de que o músculo humano adulto contém 19,8% de proteína (33), pode-se estimar que o músculo contém 232 μmol fenilalanina/g de proteína muscular. Se este valor for tomado como representativo das reservas de proteína corporal, indicaria que ≈70 μmol fenilalanina/kg de peso corporal por 12 h seria liberado durante o período de jejum. Com base nas mesmas suposições feitas acima na estimativa da taxa de transaminação da fenilalanina, o último valor se traduziria em uma taxa horária de degradação líquida de proteína (e de liberação de fenilalanina deste processo) de 0.012 μmol/ml por h. Como o substrato para esta reação, ou seja, as reservas corporais de proteína, provavelmente permaneceriam relativamente constantes durante um curto período de jejum, a degradação da proteína foi assumida como seguindo uma cinética de ordem zero.
Substituindo os valores estimados para as constantes cinéticas das três reacções apresentadas na Eq. 1 rende Eq. 3: 
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
A validade geral da Eq. 3 pode ser avaliada de várias formas. Primeiro, com o uso da expressão para a velocidade da reação catalisada pela HAP, incluindo as constantes cinéticas mostradas na equação, a taxa basal da reação de hidroxilação foi calculada para ser de 0,010 μmol/ml por h. Este valor concorda bem com os seguintes valores relatados para indivíduos normais com base em experimentos nos quais os indivíduos foram infundidos com l-fenilalanina: 0,013 μmol/ml por h; 0,008 μmol/ml por h (34); 0,012 μmol/ml por h (5); 0,010 μmol/ml por h (6). Um valor de 0,020 μmol/ml por h foi encontrado no último estudo quando os sujeitos foram infundidos com l-fenilalanina (6). As taxas in vivo citadas para a conversão da fenilalanina em tirosina foram todas relatadas como μmol/h por kg. Elas foram convertidas para μmol/ml por h com base nas mesmas suposições usadas anteriormente, ou seja, que a distribuição de volume de metabólitos como a fenilalanina é de 500 ml/kg de peso corporal. Estes resultados mostram que a taxa calculada de fenilalanina hidroxilada concorda bem com as taxas experimentalmente determinadas.
Outro teste da validade do modelo é calcular o nível de fenilalanina no sangue em estado estacionário tanto para indivíduos de controle como para heterozigotos PKU que se presume terem 50% da atividade normal de HAP, bem como o t1/2 para a liberação de uma carga de fenilalanina (ou seja o tempo necessário para que a concentração inicial de fenilalanina diminua para metade do seu valor original) a partir do sangue para estes dois grupos. O nível estável de fenilalanina para controles, calculado a partir da Eq. 3 (definindo o termo “-dPhe/dt” igual a zero e calculando a concentração de fenilalanina), é de 0,059 mM e para indivíduos com 50% de atividade residual de HAP é de 0,079 mM, 1,34 vezes maior do que o nível de controle. Embora o valor de 0,059 mM para indivíduos normais concorde bem com o valor aceito de 0,058 ± 0,015 mM (média e DP) (35), o valor de 0,079 mM para heterozigotos que poderiam ter 50% do nível normal de HAP, parece ser muito baixo. A razão dos níveis de fenilalanina no sangue para controles e para heterozigotos PKU obrigatórios tem sido relatada como estando na faixa de 1,57-1,61 (36-38) ao invés da razão de 1,34 que foi prevista pelo modelo.
Este valor calculado aumenta a possibilidade de que heterozigotos PKU possam ter menos de 50% da atividade de HAP de controle. A substituição de um valor de 40% da atividade de PAH de controle para heterozigotos por Eq. 3 produz uma concentração de fenilalanina em estado estacionário de 0,093 mM; com o uso deste valor e do valor de 0,058 mM para controles, obtém-se uma razão de 1,60, que está próxima da faixa relatada para heterozigotos e controles (ver acima). A este respeito, deve-se observar que a atividade residual de HAP em amostras de biópsia hepática encontradas para seis HPA obriga os heterozigotos a variarem entre 5,8 e 31% dos valores de controle (39). Estes resultados forneceram a primeira indicação de que os heterozigotos de HPA têm significativamente menos de 50% da atividade de controle. Dois estudos posteriores maiores de pais de pacientes com PKU estavam de acordo com estes resultados anteriores: um estudo relatou um valor médio de 29,3% dos controles (n = 9) (40) e outro relatou um valor médio de 28,1% (n = 8) (41).
O modelo também prevê valores t1/2 para a liberação de fenilalanina do sangue tanto para os normais quanto para os heterozigotos que estão de acordo com os resultados clínicos reais. Para normais, obtém-se um valor de 65 min, que é inferior ao valor médio relatado de 89 min, mas bem dentro da faixa de 60-120 min (10). Para heterozigotos com 50 e 40% de atividade HAP residual, os valores t1/2 calculados a partir da Eq. 3 são 144 e 180 min, respectivamente, comparados com um valor médio relatado de 159 min .
Referência foi feita anteriormente a um relato de dois pacientes com HPA cuja incapacidade de metabolizar fenilalanina pareceu ser resultado de uma deficiência de transaminase (11) e a evidência contra esta conclusão (12). O presente modelo fornece uma razão adicional para ver esta alegação com cepticismo. A figura 2 mostra o curso temporal do desaparecimento de 1 mM de fenilalanina do plasma de um sujeito de controle (curva A), bem como de um sujeito sem a transaminase, mas com níveis normais de HAP (curva B). Como pode ser visto, as duas taxas são quase as mesmas, tornando extremamente improvável que a HPA pronunciada possa ser causada pela falta de transaminase. A razão para a quase identidade das duas taxas é que a taxa de desaparecimento da fenilalanina na ausência total de HAP (curva D) é muito pequena, sendo a taxa inicial de apenas 2,6% da de um controle com níveis normais de HAP. A figura 2 (curva C) também mostra a taxa de desaparecimento da fenilalanina em um indivíduo com 40% do nível normal de HAP, um déficit de atividade de HAP que, como discutido acima, pode representar a média para heterozigotos de PKU.
Calcular taxas de depuração de uma carga de fenilalanina para controles e para indivíduos com genótipos diferentes. A, controles; B, sujeito com atividade de transaminase zero; C, sujeito com 40% de atividade de PAH controle; D, sujeito com 0% de atividade de PAH controle.
Recentemente, os pacientes com PKU foram classificados por meio da atribuição de categorias fenotípicas com base na sua tolerância alimentar à fenilalanina. Os pacientes com PKU clássica toleram menos de 20 mg/kg de fenilalanina por dia para manter seus níveis sanguíneos de fenilalanina no nível aceito de 0,3 mM, aqueles com “PKU moderada” toleram 20-25 mg/kg por dia, e aqueles com “PKU leve” toleram 25-50 mg/kg por dia (42).
Para ver se estes valores de tolerância de fenilalanina na dieta são coerentes com as previsões feitas pela Eq. 3, foi assumido que a ingestão da quantidade permitida de fenilalanina foi dividida igualmente em três “refeições”. Para pacientes PKU clássicos com uma ingestão de fenilalanina de 15 mg/kg por dia, cada refeição conteria 5 mg/kg por dia e adicionaria 0,06 μmol/ml ao valor de base de 0,30 μmol/ml para um nível total de fenilalanina plasmática de 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Substituindo este valor por Eq. 3 (assumindo que Vmax para um paciente PKU clássico é igual a zero), -dPhe/dt é igual a 0,001 μmol/ml por h, ou seja, a este nível de fenilalanina, a velocidade do desaparecimento da fenilalanina através da reação de transaminação mal excede a velocidade de entrada da fenilalanina no pool plasmático através da degradação da proteína líquida. Portanto, Eq. 3 prevê que estes pacientes com PKU poderiam tolerar uma ingestão de fenilalanina de 15 mg/kg por dia.
Calculado da mesma forma, pacientes “moderados PKU” com tolerância de 25 mg/kg de fenilalanina na dieta por dia exigiriam uma atividade residual de PAH igual a 15% da do tipo selvagem para metabolizá-la em 3.5 h. Da mesma forma, pacientes “moderados de PKU” com tolerância dietética à fenilalanina de 50 mg/kg por dia exigiriam um nível residual de HAP de 25% do nível do tipo selvagem para metabolizar a fenilalanina adicionada em cerca de 3.5 h. Estes resultados indicam que Eq. 3 pode ser responsável pela tolerância à fenilalanina dietética observada nestes diferentes grupos de pacientes.
Seria útil tentar correlacionar estas estimativas da atividade residual de HAP para os pacientes com “PKU leve” e “PKU moderada” com a atividade residual de hidroxilase medida in vitro para as espécies de HAP mutantes abrigadas pelos pacientes. Atualmente, porém, tal tentativa é dificultada porque há muita dispersão nos dados in vitro. Assim, vários pacientes classificados como tendo “PKU moderada” (42) demonstraram abrigar as três seguintes formas mutantes de HAP (com suas atividades residuais de HAP in vitro expressas como uma porcentagem das atividades do tipo selvagem, mostradas entre parênteses): L348V (25%), R261Q (30%, 47%), e R158Q (10%) (43). Pode-se observar que estes valores variam quase 5 vezes. Como discutido anteriormente (2, 43), em geral, as estimativas in vitro da atividade residual de hialoxilase dos mutantes da HAP tendem a ser mais altas do que as observadas nas biópsias hepáticas. Pelo menos uma razão para esta tendência é que as atividades de HAP in vitro são habitualmente medidas usando concentrações saturantes de fenilalanina e BH4, como foi feito para o mutante R261Q (44). Dada esta situação, é possível que as atividades residuais de HAP estimadas com o uso de Eq. 3 possam ser uma melhor reflexão em atividades in vivo do que aquelas medidas in vitro.
O presente modelo de metabolismo da fenilalanina é relevante para a conclusão de Thompson e seus colegas (45, 46), com base nos resultados obtidos pela infusão de indivíduos com fenilalanina e tirosina marcados com deutério, que os pacientes clássicos com PKU têm atividade “substancial” de HAP que é igual a cerca de 76% da dos indivíduos controle. Esta atividade surpreendentemente elevada de fenilalanina-hidroxilating foi atribuída à tirosina-hidroxilase (45). Como já discutido, os resultados resumidos na Fig. 2 mostram que na ausência de HAP, uma dose de fenilalanina é liberada do sangue a menos de 3% da taxa observada nos indivíduos controles. Não há indicação, a partir da presente análise, de que exista qualquer via alternativa em humanos que possa dispor de grandes quantidades de fenilalanina. Recentemente, van Spronsen et al. (34) apontaram um potencial problema metodológico com o método utilizado por Thompson e colegas de trabalho.
Em resumo, os resultados quantitativos obtidos com o modelo para o metabolismo da HAP são coerentes com dados que indiretamente refletem a atividade in vivo da HAP, tais como os níveis de fenilalanina no sangue em estado estacionário, taxas de depuração (convencionalmente expressas como valores t1/2) da fenilalanina do sangue após uma carga de fenilalanina, e tolerância dietética para a fenilalanina. O modelo tem o potencial de estimar quantitativamente a atividade residual de HAP a partir de qualquer um destes valores, particularmente a partir das taxas de depuração medidas de uma carga de fenilalanina. Os níveis previstos de PAH residual ou os valores derivados podem ser úteis na tomada de decisões sobre o quão rigorosa deve ser a restrição dietética da fenilalanina para alcançar o nível desejado de fenilalanina no sangue. A Tabela 1 resume os valores de t1/2 e os níveis de fenilalanina no sangue em estado estacionário calculados a partir da Eq. 3 (assumindo que não haja ingestão de fenilalanina durante o período do teste) para diferentes níveis de PAH residual, bem como valores comparáveis a partir de dados clínicos relevantes.
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Níveis sanguíneos de fenilalanina em estado estacionário e t
valores para a depuração de fenilalanina calculados a partir da Eq. 3 para vários níveis de PAH
Pés
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↵* A quem devem ser endereçados os pedidos de reimpressão. e-mail: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABREVIATIONS
PAH, fenilalanina hidroxilase; PKU, fenilcetonúria; HPA, hiperfenilalaninemia; PAG, fenilacetilglutamina