Apesar da produção de níveis significativos de fosfato em nossos ensaios, entretanto, não conseguimos detectar nem o consumo de O2 (por meio de medidas sensíveis do eletrodo de O2) nem a produção de H2O2 (por meio de um ensaio sensível de peroxidase de rábano silvestre). Além disso, a oxidação do Pt foi observada em taxas similares sob condições estritamente anaeróbicas em ensaios que incluíam apenas BAP, Pt e água. Estes dados sugerem fortemente que os prótons derivados da água são o aceitador de elétrons ausente para a reação de oxidação do Pt e que o outro produto da reação era provavelmente o H2 molecular, de acordo com a Eq. 2. Em apoio a esta hipótese, detectamos a produção de H2 dependente do Pt, tanto in vitro como in vivo. Ensaios in vitro foram realizados aerobicamente em frascos selados, utilizando BAP altamente purificado. Após a incubação, o headspace foi analisado para H2, e a porção aquosa foi testada para fosfato. Como mostrado na Fig. 2B, quantidades estequiométricas de fosfato e H2 foram produzidas a partir de Pt na presença de BAP, enquanto nem fosfato nem H2 foram produzidos em reações de controle contendo BAP ou Pt sozinhos.

A medição de H2 in vivo é complicada pelo fato de E. coli ter múltiplas hidrogenases que podem tanto produzir como consumir H2. Para contornar este problema, construímos um mutante ΔhypABCDE, que não pode produzir nenhuma hidrogenases ativa devido à sua incapacidade de amadurecer as proteínas precursoras (32). O hipo mutante, cultivado aerobicamente em tubos selados, também produziu quantidades aproximadamente estequiométricas de H2 em culturas cultivadas com níveis de Pt limitantes de crescimento, enquanto que nenhum H2 foi detectado em culturas cultivadas com níveis limitantes de fosfato ou fosfoserina de éster de fosfato (Fig. 2B ).

A Oxidação do Pt não é uma característica comum de todas as Fosfatases Alcalinas. A oxidação eficiente da Pt parece ser uma característica única da E. coli fosfatase alcalina. Nem Bacillus subtilis, que é conhecido por produzir múltiplas fosfatases altamente ativas (33), nem P. stutzeri, que é conhecido por produzir uma fosfatase distinta de BAP (em cepas que não possuem o sistema Pt desidrogenase) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson e W.W.M., dados não publicados), podem usar Pt como única fonte de P (Fig. 3A ), embora ambos os organismos cresçam em meios com fosfoserina como única fonte de P (dados não mostrados). Assim, as fosfatases produzidas por estes organismos são incapazes de oxidar o Pt a taxas suficientes para suportar o crescimento. Também testamos preparações comerciais de fosfatase intestinal de bezerro (CIP) e fosfatase alcalina de camarão (SAP) por sua capacidade de produzir fosfato a partir do Pt (Fig. 3B ). Embora pequenas quantidades de fosfato tenham sido produzidas pelas fosfatases eucarióticas após a incubação da noite, apenas a E. coli BAP foi capaz de catalisar a reação a taxas significativas. Este achado é particularmente surpreendente porque as enzimas eucarióticas são na verdade muito melhores fosfatases, com atividades específicas até 40 vezes maiores do que a BAP (27). Todas essas enzimas compartilham homologia significativa (25-35% de identidade) com a E. coli BAP; além disso, a maioria dos resíduos do local ativo, incluindo o Ser-102 (que forma uma enzima fosfatase intermediária covalente durante a reação fosfátase), são conservados (27).

Parece ser plausível que a oxidação do Pt seja catalisada pelo BAP por um mecanismo similar ao usado para a hidrólise do éster de fosfato (Fig. 4A ). Assim, Pt pode ser hidrolisado por BAP com anião hidreto como o grupo de saída formal. Em apoio a esta idéia, um mutante phoA com o resíduo ativo Ser-102 alterado para alanina é incapaz de usar Pt como única fonte de P, indicando que este aminoácido é necessário para hidrólise de éster de fosfato (27) e para oxidação de Pt (Fig. 4B ). Embora a transferência directa de hidreto de um substrato para um próton aquoso seja bioquimicamente sem precedentes, esta reacção é termodinamicamente razoável dado o forte potencial de redução do casal fosfato-Pt (E o′ = -0,650 V). Assim, a reacção de produção de H é bastante favorável: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (calculado a partir dos potenciais redox na ref. 34). Se o modelo hidrolítico para a oxidação do Pt se revelasse correto, seria uma reação enzimática muito incomum. Estudos demonstraram que o BAP também é capaz de hidrolisar fosfodiesters (35), fosfoamidas (36), ésteres sulfatados (37) e tiofosfato (38). Entretanto, essas reações ocorrem em taxas consideravelmente mais lentas do que as da reação de hidrólise do Pt, apesar de envolverem grupos de saída muito melhores. Além disso, não são reações redox. A reação análoga envolvendo hidrólise de ácidos alquilfosfônicos não é catalisada pelo BAP, como mostrado tanto bioquimicamente (39) como pela incapacidade do Δphn estirpes de usar estes compostos como fontes únicas de P (13).

Pt desidrogenase (PtxD) tinha sido a única enzima in vitro-caracterizada mostrada para catalisar a oxidação Pt (11). Embora os detalhes da reação BAP ainda estejam por esclarecer, os mecanismos químicos das duas enzimas são claramente distintos. Enquanto PtxD requer NAD como o aceitador de elétrons para a reação redox, a reação catalisada por BAP não requer aceitadores de elétrons exógenos, mas explora a grande força motriz termodinâmica da reação para produzir um produto altamente reduzido (H2) a partir da água em uma reação essencialmente irreversível (K eq calculado = 1,1 × 108). Todas as outras reacções conhecidas de produção de H2 operam muito mais próximas do equilíbrio químico e são tipicamente reversíveis. Além disso, todas as outras hidrogenases conhecidas contêm Fe ou Ni, ou ambos, em seus locais ativos (40). Esta observação inclui a chamada metileno-tetrahidrometanopterina desidrogenase metanogênica sem metal da arca metanogênica, que agora é conhecida por conter também Fe (41). Em contraste, BAP não contém metais ativos redox, embora tanto Zn quanto Mg sejam necessários para a atividade hidrolítica (27). O tratamento do BAP com quelantes inibe a oxidação do Pt, sugerindo que os metais desempenham um papel na reação Pt (dados não mostrados).

Finalmente, os dados in vivo aqui apresentados sugerem que a reação de oxidação do Pt é biologicamente relevante. A observação de que muitas bactérias possuem enzimas dedicadas à oxidação do Pt demonstra que o traço está sob forte pressão seletiva em populações microbianas (4, 5, 9, 42). Com este fato em mente, é interessante notar que embora as enzimas eucarióticas sejam muito melhores fosfatases, elas são incapazes de oxidação do Pt. Esta observação levanta a possibilidade de que a E. coli BAP possa não ter evoluído para ser a fosfatase mais eficiente, mas sim para ser uma fosfatase com a capacidade de hidrolisar Pt. Esta idéia é consistente com a curiosa observação de que a E. coli BAP é muito bem expressa (até 6% da proteína celular total) sob condições de inanição por fosfato (28). A explicação tradicional para este fenômeno é que algum substrato desconhecido de BAP deve ser pouco hidrolisado e, portanto, requer quantidades maciças de enzimas para suportar taxas de crescimento competitivas. Contudo, como há pouca diferença nas taxas de hidrólise medidas para uma grande variedade de substratos de ésteres de fosfato (39, 43), parece improvável que este pobre substrato possa ser um éster de fosfato. Em contraste, a taxa de hidrólise de Pt é substancialmente inferior à taxa de hidrólise de éster fosfato, sugerindo que o Pt pode ser o substrato que explica o nível extremo de expressão de phoA observado em E. coli com fome de fosfato.

Claramente, muitos detalhes da reação de BAP com Pt ainda não foram elucidados. Um estudo mais aprofundado desta reação única provavelmente contribuirá não apenas para nossa compreensão da química do P redox e reações de transferência de fósforo, mas também para nosso conhecimento da transferência de hidreto, reações produtoras de H2, e o papel dos compostos de P reduzidos na natureza.