La amplificación de MYC disminuye la supervivencia a través de múltiples tumores malignos humanos

Uno de los TFs clave que regulan la proliferación de células de mamíferos es la oncoproteína viral de la mielocitomatosis (MYC), cuya función se conserva a través de las jerarquías evolutivas27,28,29,30,31. Fisiológicamente, la proliferación regulada por MYC es sucedida por programas de diferenciación de linaje que antagonizan a MYC para terminar la proliferación20. Analizamos las alteraciones de MYC mediante dos enfoques. En primer lugar, analizamos las alteraciones del número de copias (CN) en el locus MYC utilizando los datos de TCGA e ICGC disponibles a través de la plataforma cBioPortal y encontramos frecuentes amplificaciones y ganancias de MYC (Fig. 1a). A continuación, accedimos a los datos pan-cáncer de TCGA (PANCAN) que contenían 11.000 pacientes en 33 de los tumores más prevalentes y los analizamos a través de Xena Browser. MYC estaba altamente amplificado en estos tumores malignos8,10. En ambos conjuntos de datos, los cambios en el CN de MYC se determinaron mediante el método de puntuación GISTIC, en el que los valores de -2,-1,0,1,2, representaban deleción homocigótica, deleción heterocigótica, diploide, amplificación de bajo nivel o amplificación de alto nivel32. A continuación, realizamos un análisis de supervivencia utilizando las puntuaciones GISTIC que predecían la deleción de bajo nivel/tipo salvaje de MYC, frente a la ganancia/amplificación utilizando el conjunto de datos de PANCAN. La amplificación de MYC se correlacionó con una menor supervivencia global (p < 9,784 × 10-11, n = 2628) en comparación con los casos con MYC CN WT/deleciones de bajo nivel (n = 1352) (Fig. 1b). A continuación, analizamos la correlación entre las puntuaciones GISTIC en el locus MYC frente a la expresión de ARNm de MYC y la supervivencia de los pacientes. Hubo una fuerte correlación (r de spearman = 0,3339, p < 0,0001, n = 9697) entre la puntuación GISTIC de MYC y la expresión de ARNm de MYC (Fig. 1c). Los niveles altos (n = 1762) frente a los bajos (n = 1776) de ARNm de MYC se asociaron con una disminución (p < 5,609 × 10-8) de la supervivencia global (Fig. 1d). Por lo tanto, MYC es un oncogén vital en muchas neoplasias humanas y la identificación de mecanismos para antagonizar MYC en el cáncer podría tener aplicaciones terapéuticas. La función de MYC se conserva en todas las jerarquías evolutivas27,28,29,30,31. El ciclo vital simple de los protozoos requiere que MYC genere células hijas que se parezcan a sus células parentales con cada división celular27,29. La evolución desde el organismo unicelular a los organismos multicelulares llevó a un uso intenso de energía para abrir la cromatina y exponer el ADN desnudo permitiendo que los TFs de linaje se unan y activen cientos de genes de diferenciación terminal que guían el destino celular y la especialización en varias capas de células. Este proceso no requiere que las células proliferen activamente. Por lo tanto, la proliferación mediada por MYC es potentemente antagonizada en esta etapa33,34 (Fig. 1e). Esta forma de antagonismo potente de MYC es también necesaria para la existencia de la multicelularidad29,35. De forma convincente, la infección de organismos multicelulares con parásitos protozoarios potencia la transformación de las células infectadas en células proliferativas mediante complejos mecanismos que activan la proteína MYC y suprimen los TFs de diferenciación27,29,36.

A diferencia de las células normales, las células malignas experimentan una proliferación sin diferenciación terminal (Fig. 1e, f). Este proceso aberrante depende en gran medida de la estabilización de MYC y sus coproductos que modulan el crecimiento y la división celular17,20,37,38,39. Las alteraciones genéticas y epigenéticas aseguran que la proliferación persistente de progenitores comprometidos con el linaje se produzca sin diferenciación final en las células cancerosas (Fig. 1e)7. En primer lugar, la proliferación persistente se consigue mediante la regulación ascendente consistente y las ganancias cromosómicas del locus genético que codifica el gen MYC en todas las neoplasias humanas (Fig. 1a). La amplificación de MYC predice una pobre supervivencia global (valor p de LogRank = 9,784 × 10-11, n = 3980) (Fig. 1a, b). En los estudios que utilizan modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) o modelos de xenoinjerto de cáncer, antagonizar MYC mantiene la regresión tumoral en múltiples tumores39,40,41. Por ejemplo, Shachaf et al. desarrollaron un modelo de ratón transgénico que expresaba condicionalmente MYC en los hepatocitos utilizando una expresión controlada por tetraciclina39. La inactivación de Myc indujo la regresión del CHC murino aumentando los hepatocitos y la diferenciación de las células hepatobiliares, la pérdida del marcador de CHC α-fetoproteína y la supresión de la proliferación39. En un modelo de xenoinjerto de PDAC, Zhang et al. dirigieron la dimerización de MYC-MAX con una pequeña molécula (10058-F4) que interrumpe la actividad transcripcional de MYC40. La adición de 10058-F4 a la gemcitabina condujo a una drástica atenuación de la tumorigénesis en comparación con el tratamiento con un solo agente40. Utilizando un modelo de ratón de cáncer de pulmón impulsado por Kras, Soucek et al. se dirigieron a MYC utilizando un mutante del dominio de dimerización de MYC dominantemente negativo que interrumpía la unión de MYC al elemento de respuesta canónico Myc E-box ‘CACGTG’, inhibiendo así la actividad de transactivación de MYC41. La inhibición de la transactivación de MYC aumentó la supervivencia de los ratones al poner fin al crecimiento del cáncer de pulmón41.

Desde el punto de vista de la traducción, existen varios retos en el intento de dirigirse directamente a MYC de forma farmacológica42. El reto más importante es que la proliferación es una característica de los progenitores normales y dicha terapia podría tener un índice terapéutico pobre20. Además, los tumores tienen antecedentes genéticos heterogéneos que contribuyen a la actividad sostenida de MYC. Por lo tanto, para entender los mecanismos que antagonizan las acciones excesivas de MYC, es imperativo definir los métodos fisiológicos conservados evolutivamente por los que los progenitores normales antagonizan MYC para desactivar la proliferación intensa y cómo se pueden restaurar en el cáncer.

La terminación de la proliferación mediante la activación de la apoptosis es tóxica para las células normales en división

Para mantener la cohesión y la integridad entre los diferentes tipos de células, los organismos multicelulares han desarrollado un sistema de controles y equilibrios conocido colectivamente como apoptosis43,44. Los TFs maestros de la apoptosis p53 (TP53) y su cofactor p16 o p14ARF (CDKN2A) desempeñan papeles cruciales al detener las células en proliferación para permitir la reparación del daño, o iniciar el suicidio ordenado si dicho daño no puede ser reparado45,46. Durante la embriogénesis, la expresión de p53 está regulada a la baja, quizá porque las células madre embrionarias se autorrenovan sin proliferar exponencialmente47,48,49. Los estudios funcionales de la expresión diferencial de p53 utilizando ensayos de reportero demostraron una mayor expresión en las etapas posteriores del desarrollo, y una menor expresión en las células diferenciadas terminalmente48. Durante la división celular, las vías de p53 antagonizan potentemente las vías de MYC para detener la proliferación y permitir que las células dañadas se reparen; las células irreparables se autodestruyen mediante apoptosis irreversible para proteger la integridad de todo el organismo43. Dado que los ratones con bloqueo de p53 (KO) tienen un desarrollo normal y no se agrandan50 , esto ilustra que las vías de apoptosis no son los mecanismos dominantes utilizados por los progenitores de linaje para poner fin a la proliferación exponencial. Así, los ratones que presentan un doble KO de Trp53 y del homólogo de la fosfatasa y la tensina (Pten) desarrollan tumores de glioma al no antagonizar MYC, pero este fenotipo sólo se observa en los knockouts dobles de Trp53 y Pten45,46. En el PDAC la mutación genética más frecuente es KRAS (~92%). Los GEMM en los que el KRAS mutante (ratones KC) se expresa en las células del páncreas desarrollan PDAC en un 30 a 40% de los casos a los ~8-12 meses de edad51. La adición de Trp53 mutante al GEMM anterior (ratones KPC) aumenta la penetración del PDAC y disminuye la supervivencia a ~5 meses, mientras que los ratones KC con deleción de Ink4a sobreviven durante ~2-3 meses52,53. Los ratones con Trp53 mutante solo sin Kras mutante no desarrollan PDAC53. Por el contrario, en modelos de ratón de cáncer de ovario se ha demostrado que la inactivación de Trp53 da lugar a tumores invasivos, pero el desarrollo del tumor se acelera en los ratones con inactivación concomitante de Brca1 y Trp5354.

TP53 y CDKN2A están frecuentemente inactivados de forma bialélica en las neoplasias humanas (Fig. 2a). Esta inactivación tiene un gran impacto en el tratamiento7. Para acabar con la proliferación maligna, los quimioterapéuticos convencionales pretenden aumentar la regulación de p53/p16 induciendo un estrés citotóxico que imita los activadores fisiológicos de esta vía55. Dado que las células malignas y las células normales coexisten en el mismo medio, dicho tratamiento tiene un índice terapéutico desfavorable, ya que estos genes están mutados/no disponibles físicamente en las células malignas, pero intactos en las células normales. Se han investigado múltiples métodos para reactivar la apoptosis en la terapia del cáncer, pero ha sido difícil abordar esta cuestión fundamental del índice terapéutico56. Los avances en las técnicas genómicas indican que cuando los genes TP53/CDKN2A son de tipo salvaje, como en el cáncer testicular, el tratamiento con quimioterapia citotóxica (por ejemplo, cisplatino) produce respuestas completas que aumentan la supervivencia global y libre de enfermedad57 (Fig. 2a, b). Los tumores malignos con altas tasas de inactivación de TP53/CDKN2A no presentan estas respuestas, lo que conduce a una resistencia a múltiples tratamientos basados en la apoptosis (quimiorresistencia amplia y radio-resistencia) (Fig. 2a, b, e, f)7. Incluso diferentes tipos de tumores originados en el mismo órgano presentan mejores respuestas a la terapia si los genes de la apoptosis están intactos. Por ejemplo, las mutaciones en TP53 y CDKN2A ocurren en ~70 y 90% de los PDAC, respectivamente58 (Fig. 2a). La tasa de supervivencia global a los 5 años en el PDAC es de ~9% incluso cuando se incluyen los pacientes tratados con quimioterapia o terapias combinadas y/o cirugía59,60. Por el contrario, los tumores neuroendocrinos pancreáticos (PNETs), generalmente no albergan mutaciones en TP53, presentan sólo deleciones mínimas de CDKN2A61, y tienen una tasa de supervivencia a 5 años de >50% cuando son tratados con terapia inductora de apoptosis62. Del mismo modo, el glioblastoma multiforme (GBM) presenta una variedad de características clínicas, histopatológicas y moleculares, y alberga mutaciones TP53 en ~30% de los casos primarios y ~65% de los GBM secundarios63,64. Las células de glioma con TP53 WT responden al estrés citotóxico inducido por los agentes quimioterapéuticos disponibles clínicamente, en comparación con aquellas con TP53 mutante transcripcionalmente silenciado65,66,67. Además, en el modelo de ratón de PDAC inducido por Trp53 (KPC), la inactivación genética de un alelo de Myc sensibiliza la respuesta terapéutica a la gemcitabina40. Por lo tanto, analizamos los datos genómicos comparando los diez primeros tumores malignos con una frecuencia elevada de alteraciones de TP53/CDKN2A (TP53/CDKN2A-high) con los diez últimos tumores malignos con una frecuencia baja de alteraciones de TP53/CDKN2A (TP53/CDKN2A-low) (Fig. 2b, c). Encontramos que 7/10 de los cánceres con alta frecuencia de TP53/CDKN2A tenían una disminución de la supervivencia libre de enfermedad y global cuando estos genes estaban mutados (Fig. 2b; Tabla S1) (valores p < 0,05). De forma consistente, incluso en los casos con TP53/CDKN2A bajo, hubo una disminución de la supervivencia libre de enfermedad y global cuando estos genes estaban alterados (valores de p < 0,05) (Fig. 2c; Tabla S1). Por lo tanto, la tasa de alteraciones en los genes de apoptosis es menor en las neoplasias malignas curables (cáncer testicular/ LLA pediátrica) en comparación con los cánceres altamente refractarios/resistentes al tratamiento (PDAC/HCC) (Fig. 2g). Durante la maduración fisiológica, el TP53 WT induce la apoptosis irreversible de las células no sanas para conservar la integridad de todo el organismo (Fig. 2h). Por el contrario, la evolución oncogénica muta los mediadores de la apoptosis conduciendo a la resistencia a la inducción de la apoptosis (Fig. 2h).

Alteraciones genéticas y epigenéticas de los genes de diferenciación en el cáncer

Las neoplasias humanas más agresivas son poco diferenciadas13. Aunque la diferenciación contribuye a la escasa supervivencia en múltiples neoplasias humanas, los mecanismos que sustentan el impedimento de la diferenciación en las células malignas no están claros en su mayoría, pero están surgiendo nuevos conocimientos5,6,7. Identificamos los TF maestros de linaje clave para el desarrollo del ovario, el páncreas y el hígado utilizando estudios de conversión de linaje publicados, o estudios con modelos de ratón transgénicos6,68,69,70,71,72,73,74 (Tabla 1). Los programas de diferenciación celular y compromiso de linaje están dictados por este puñado de TFs maestros y sus cofactores. Aunque hay múltiples cofactores que desempeñan funciones importantes, los más importantes son los coactivadores transcripcionales y los corepresores que utilizan el ATP para remodelar la cromatina y activar o desactivar los genes objetivo33,34,75. En consecuencia, analizamos las alteraciones genéticas en los FT de linaje, sus coactivadores y corepresores en OVC, PDAC y HCC (Tabla 1).

Dado que las células malignas no pueden suprimir completamente la diferenciación, ya que es un continuo a lo largo del cual existen todas las células, los FT maestros que especifican el compromiso en varios linajes casi nunca están completamente inactivados por mutación, sino que son frecuentemente haploinsuficientes (Fig. 3a; Tabla 1). Esta reducción de la dosis es suficiente para detener los avances a lo largo del continuo de diferenciación en sus puntos más proliferativos5,6,7. Por ejemplo, la pérdida de FOXL1 fue frecuente en las CVO (Fig. 3a), y la frecuencia de pérdida de FOXL1 fue mayor en las CVO poco diferenciadas (Fig. 3b). Este patrón fue similar para GATA4 en PDAC y HCC, a pesar de que estos tumores malignos tenían un pequeño número de pacientes que sobrevivían más allá de los estadios I y II (Fig. 3b, c). Identificamos socios de interacción clave que son coactivadores y corepresores de varios TFs específicos de linaje (Tabla 1) mediante el análisis de la literatura y los datos depositados en la base de datos UniProt (http://www.uniprot.org/). Para aumentar la diferenciación estancada, los coactivadores se encontraron frecuentemente inactivados y eliminados (Tabla 1; Fig. 4a) favoreciendo la represión de los genes aguas abajo dirigidos por TFs clave. Nuevas líneas de evidencia implican ahora que tales alteraciones perjudican las vías que median la diferenciación terminal6,7,76. Los primeros descubrimientos de las funciones de estas enzimas coactivadoras demostraron que su papel en la fisiología era utilizar el ATP para movilizar las interacciones de las histonas con el ADN de forma que el ADN desnudo quedara expuesto, permitiendo así que los TFs se unieran a los genes diana y los activaran33,34,75,77. Este proceso se conserva en la evolución desde la levadura78, uno de los metazoos más simples, hasta el homo-sapiens77. La inactivación de estos genes en el cáncer podría ser un intento de perjudicar la capacidad de los coactivadores para exponer el ADN a los TFs maestros que activan los genes aguas abajo. Una pista importante para esta hipótesis es que los TFs maestros de linaje son selectivos en su uso de coactivadores específicos para mediar la activación de los genes de linaje (Tabla 1). Otra pista es que las células malignas tienden a perder un alelo de los TFs especificadores de linaje, un evento que puede ser suficiente para permitir el compromiso de linaje pero insuficiente para la diferenciación terminal6,7 (Fig. 3a; Tabla 1). Por ejemplo, los progenitores hepáticos requieren la cooperación entre GATA4 y FOXA1 para reclutar coactivadores (por ejemplo, ARID1A) y mediar la activación de los genes de diferenciación de los hepatocitos. En el CHC, la pérdida heterocigótica de GATA4 es frecuente (68%, n = 366, Fig. 3a; Tabla 1) y las mutaciones inactivadoras en ARID1A son comunes (44%, n = 366, Fig. 4a; Tabla 1)6. La diferenciación hepática está deteriorada y la proliferación aumentada en los hígados con haploinsuficiencia hepática condicionada por Gata4 o Arid1a6,76,79. Además, la reintroducción de GATA4 en HCC con deficiencia de GATA4, o de ARID1A en HCC con mutación de ARID1A pero con GATA4 intacto, activa cientos de genes de diferenciación epitelial de los hepatocitos6. Los TFs maestros del linaje pancreático incluyen GATA4 y GATA680,81. Las pérdidas de número de copias de un alelo de estos factores se observan en el PDAC, con mutaciones de pérdida de función en los coactivadores también observadas (Tabla 1; Figs. 3a, 4a). Sin embargo, los PDACs también mostraron una alta incidencia de amplificación o ganancia de GATA4 y GATA6, sugiriendo que en ciertos casos estos TFs pueden conferir una ventaja de crecimiento a las células de cáncer de páncreas. En el CVO, uno de los alelos de los TFs maestros del ovario FOXL182,83 se pierde con frecuencia (80%, Fig. 3a; Tabla 1 n = 316), mientras que los coactivadores, como ARID3A y ARID3B, suelen estar inactivados (Tabla 1; Fig. 4a). Por lo tanto, en el núcleo de la transformación maligna, el impedimento de la diferenciación mejora de forma rutinaria la proliferación maligna y se consigue a través de la haploinsuficiencia de los TFs maestros y la inactivación de los coactivadores que utilizan. Esta comprensión podría conducir a tratamientos destinados a reactivar la diferenciación hacia adelante, como alternativa a la apoptosis, como medio para poner fin a la proliferación maligna.

Enzimas corepresoras: objetivos emergentes para la oncología restauradora de la diferenciación

Un enhanceosoma se compone de complejos multiproteicos que cooperan para activar genes de un linaje determinado84,85, por ejemplo, los enhanceosomas hepáticos activan los genes de los hepatocitos6, mientras que los enhanceosomas pancreáticos y ováricos activan los genes pancreáticos86 y ováricos87, respectivamente. La alteración genética de esta cooperación puede hacer que el contenido de estos núcleos proteicos se aleje de los coactivadores y se convierta en corepresores que reprimen los genes del linaje76,88,89. Esta represión se ve favorecida por el estado inherente de cromatina cerrada de los genes de diferenciación terminal, que contrasta con la cromatina inherentemente abierta de los genes de proliferación y diferenciación temprana6,7,90.

Para que la proliferación exponencial se produzca desvinculada de la diferenciación hacia delante, es necesario un alto grado de actividad corepresora para el silenciamiento epigenético de los genes de diferenciación de linaje. En consecuencia, la actividad aberrante de los corepresores se observa con frecuencia en las células malignas, donde cientos de genes de diferenciación terminal tienen una acumulación de corepresores activos6,89. A diferencia de los coactivadores, que suelen estar inactivados por mutaciones/deleciones genéticas6, los corepresores suelen ser de tipo salvaje o estar amplificados en las células malignas (Tabla 1; Fig. 4b). La enzima ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) es un corepresor del TF maestro y también la metiltransferasa de mantenimiento que recapitula la metilación de CpG en la cadena de ADN recién sintetizada a medida que las células pasan por ciclos de división91,92,93. En los datos del TCGA PANCAN, los niveles altos de DNMT1 se asocian a una mala supervivencia (p < 0,00001, n = 5145), en comparación con los casos con niveles bajos de DNMT1 (n = 5199) (Fig. 5a). Esto sugiere un papel importante de esta enzima en numerosos cánceres humanos. Por lo tanto, en la última década se han desarrollado múltiples estudios que intentan desarrollar intervenciones terapéuticas dirigidas a la DNMT1 en la terapia del cáncer94,95,96,97,98,99,100,101,102. Asimismo, Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1, (UHRF1), coopera estrechamente con DNMT1 en la regulación de la metilación del ADN103,104. Analizamos los niveles de expresión de UHRF1 en el conjunto de datos de PANCAN y descubrimos que los niveles elevados de expresión de UHRF1 (p < 0,0001, n = 5150) predecían fuertemente las tasas de supervivencia pobres en comparación con los niveles bajos (n = 5189) (Fig. 5b), lo que ilustra la importancia de estos genes de metilación en los cánceres humanos.

La depleción de DNMT1 sin citotoxicidad tiene beneficios terapéuticos incluso en el síndrome mielodisplásico (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA) que contienen defectos del sistema p53102,105, y se están llevando a cabo múltiples ensayos clínicos para evaluar la depleción de DNMT1 de forma más amplia en la terapia del cáncer (aunque la decitabina y la 5-azacitidina utilizadas para depletar la DNMT1 tienen limitaciones farmacológicas que pueden socavar su capacidad para depletar la DNMT1 de los tumores sólidos) (Tabla 2). En la leucemia promielocítica aguda (LPA), se consiguen remisiones completas mediante la combinación de arsénico con ácido retinoico para inhibir los correpresores reclutados en la proteína de fusión leucémica PML-RARA106,107. Dado que los correpresores no están mutados y tienen una actividad aberrante en el cáncer, son dianas moleculares suficientes y lógicas que pueden comprometer a los genes de diferenciación terminal para las salidas del ciclo celular de p537,89,99,100,102,105,108,109,110,111 (Tabla 2; Fig. 5c, d).

También se han investigado otros corepresores como posibles dianas moleculares para la terapia epigenética del cáncer. Por ejemplo, las enzimas histonas deacetilasas (HDAC) son corepresores clave reclutados en los núcleos de FT de muchas neoplasias humanas y son conocidos supresores epigenéticos de la expresión génica5,6,88,89. En muchos estudios preclínicos, las enzimas HDAC se han investigado como posibles inductores de la diferenciación celular94,95. Sin embargo, uno de los problemas de las HDACs es que tienen funciones celulares pleiotrópicas, por lo que incluso la actividad dirigida puede producir efectos secundarios no deseados. Otros corepresores comunes regulados en muchas neoplasias humanas son las enzimas desmetilasas de lisina, como KDM1A (Fig. 4b). Varios estudios han demostrado la inducción de la diferenciación mediante el tratamiento farmacológico de KDM1A y actualmente se están realizando ensayos clínicos relacionados112,113,114,115,116. Utilizando un cribado in vivo de alto rendimiento para el cáncer, Carugo et al. demostraron recientemente una relación entre el corepresor WDR5 y la proliferación sostenida mediada por MYC en el PDAC117. La interrupción de WDR5 mediante ensayos de inhibición condujo a la detención de la progresión tumoral y al aumento de la supervivencia en modelos de ratón PDX de PDAC117. En esta revisión sistemática, hemos documentado otros corepresores reclutados en los núcleos del FT maestro de muchas neoplasias humanas que requieren una validación genética y farmacológica adicional como objetivos moleculares candidatos que mejoran la diferenciación. Estos incluyen HES1, BAZ1A/B, BAZ2A, EED, SUZ12 y UHRF1 (Figs. 4b, 5b; Tabla 1). Además, la regulación al alza de estos corepressors se encontró vinculada a estadios clínicos patológicos avanzados, lo que sugiere un efecto directo en la supresión de la diferenciación. Por ejemplo, se encontró que HES1 era el corepresor más frecuentemente regulado en las CVO (Fig. 4b), y las CVO en estadio III y IV tenían mayores ganancias de HES1 en comparación con los estadios I y II (Fig. 4c). Por lo tanto, la terapia de inhibición de HES1 puede ser vital para la terapia de diferenciación de OVC. Este patrón también se observó para BAZ1B en PDAC y KDM1B en HCC (Fig. 4b, d, e). Estas observaciones sugieren que, en estas neoplasias, dirigirse a estas enzimas clave para la inducción de la diferenciación podría proporcionar estrategias terapéuticas adicionales que sorteen los defectos del sistema p53.