Abstract
Se describe la derivación de un modelo cuantitativo del metabolismo de la fenilalanina en humanos. El modelo se basa en las propiedades cinéticas de la fenilalanina hidroxilasa humana recombinante pura y en las estimaciones de las tasas in vivo de transaminación de la fenilalanina y degradación de la proteína. Los valores calculados para la concentración de fenilalanina en sangre en estado estacionario, la tasa de eliminación de fenilalanina de la sangre tras una carga oral del aminoácido y la tolerancia dietética de la fenilalanina concuerdan bien con los datos de pacientes normales y fenilcetonúricos y heterocigotos obligados. Estos valores calculados pueden ayudar a decidir el grado de restricción de la ingesta de fenilalanina que es necesario para lograr un resultado clínico satisfactorio en los pacientes clásicos y en aquellos con formas más leves de la enfermedad.
El paso inicial y limitante de la velocidad en el catabolismo completo de la fenilalanina a CO2 y agua es su hidroxilación a tirosina, una reacción catalizada por el sistema hidroxilador de la fenilalanina. El sistema es complejo y consta de la fenilalanina hidroxilasa (PAH), la coenzima pterina tetrahidrobiopterina (BH4) y varias enzimas que sirven para regenerar la BH4, es decir dihidropteridina reductasa y pterina 4α-carbinolamina deshidratasa (1, 2).
Aunque el anillo bencénico de la fenilalanina no puede romperse sin ser primero hidroxilado en la posición para, la cadena lateral de la alanina del aminoácido puede metabolizarse incluso en ausencia del paso de hidroxilación del anillo. Esta vía alternativa se inicia con la transaminación de la fenilalanina a fenilpiruvato, seguida de la conversión de este último compuesto en metabolitos como el fenilactato, el fenilacetato y el o-hidroxifenilacetato. Los productos de la vía de la transaminasa se excretan en la orina. Los pasos de estas vías alternativas del metabolismo de la fenilalanina se describen en la Fig. 1.
Al principio, hay que señalar que un intento anterior de llevar a cabo un análisis de este tipo se vio obstaculizado por la falta de datos sobre las propiedades cinéticas de la HAP humana y de la fenilalanina transaminasa humana. De hecho, en el caso de esta última enzima, ni siquiera se conocía con certeza la identidad de la responsable de esta actividad in vivo. Dado que las pruebas in vitro indicaban que la fenilalanina es un excelente sustrato para la aspartato aminotransferasa mitocondrial, se asumió que ésta es la transaminasa implicada. Además, como no se conocían las propiedades de la homóloga humana, se utilizaron las propiedades cinéticas de la correspondiente enzima de rata (12). La forma en que se manejó el problema de la transaminasa humana en el presente análisis se discutirá más adelante.
Las propiedades cinéticas de la PAH humana recombinante están ahora disponibles (16, 17). La cinética de la PAH es algo complicada por el hecho de que la fenilalanina no sólo sirve como sustrato para la enzima, sino también como activador (véase la ref. 1 y sus referencias). Debido a que un análisis previo del comportamiento cinético de la HAP basado en un modelo de dos sitios con la unión ordenada de la fenilalanina tanto en un sitio catalítico como en un sitio regulador podría explicar adecuadamente muchos aspectos peculiares del comportamiento cinético de la enzima (18), en el presente análisis se utilizó un modelo similar de dos sitios con unión ordenada. La ecuación de velocidad real utilizada (19) se muestra en la Ecuación 2, donde Km es la concentración de fenilalanina que da la mitad de la velocidad máxima y Ka es la concentración de fenilalanina que da la mitad de la activación máxima en un experimento en el que la HAP se preincubó con concentraciones variables de fenilalanina. Para el presente análisis, se utilizaron las siguientes constantes cinéticas, determinadas con la PAH humana recombinante pura a 37°C con BH4 como coenzima: Km para la fenilalanina, 0,51 mM, y Ka para la fenilalanina como activador, 0,54 mM (D. Kowlessur y S.K., datos no publicados). Un valor aproximado de Vmax para la HAP humana (16) (probablemente una subestimación) se calculó a partir de la tasa inicial de disminución de los niveles séricos de fenilalanina (0,9 μmol/ml por h) en sujetos de control después de haber recibido una carga oral de l-fenilalanina que fue suficiente para aumentar sus niveles séricos de fenilalanina en ≈17 veces (20). 
2 Como se ha indicado anteriormente, en el presente análisis se obvió el problema anterior de la identidad de la enzima en el hombre responsable de la transaminación de la fenilalanina. Se asumió que la ruta principal para la eliminación neta de fenilalanina en los pacientes con PKU clásica es a través de la transaminación. Por ejemplo, como ya se ha mencionado, la excreción urinaria de fenilalanina es sólo ≈11% de la cantidad que se transamina, y, al final del primer año de vida, puede estimarse que la cantidad de fenilalanina eliminada vía incorporación a las proteínas es sólo ≈25% de la eliminada vía transaminación. Debe tenerse en cuenta que con el presente método para estimar la tasa de fenilalanina transaminasa, que se basa en la tasa de eliminación de fenilalanina de la sangre, las reacciones menores de eliminación de fenilalanina, como su excreción urinaria y su incorporación a las proteínas, se subsumen en la estimación de la actividad de la transaminasa, lo que da lugar a una pequeña sobreestimación de esta actividad.
Para que sean útiles en el presente análisis, se necesitan valores para la Km y la Vmax de la transaminasa. Se ha intentado extraer un valor de Km para la transaminación de la fenilalanina a partir de los resultados de las pruebas de carga de fenilalanina realizadas en pacientes con PKU clásica (21). El enfoque adoptado para estimar un valor de Vmax para la enzima transaminante humana fue utilizar los datos de la suma de todos los metabolitos derivados de la transaminación (es decir, fenilpiruvato, fenilactato y o-hidroxifenilacetato) excretados por un grupo de pacientes con PKU clásica en función de sus niveles de fenilalanina en plasma. La cantidad máxima excretada, expresada en mmol/mol de creatinina, fue de 1.370, un nivel que parecía estabilizarse en los niveles de fenilalanina en plasma entre 1.200 y 2.400 μmol/litro (22).
Los intentos de convertir este valor en una tasa de transaminación se complican por el amplio rango de edades, ≈2 años a ≈18 años, en la muestra de pacientes utilizada en el estudio. Para el presente análisis, se asumió que el peso corporal medio de los pacientes era de 50 kg y que la excreción diaria de creatinina era de 2 g/24 h (23). También se asumió que la excreción de metabolitos derivados de las transaminasas se produce a un ritmo lineal durante el período de 24 horas y refleja la tasa de formación de estos metabolitos. También se asumió que estos compuestos se equilibran con todos los compartimentos de fluidos corporales excepto el tejido conectivo denso del cartílago y el hueso, que, en conjunto, representan el 15% del agua corporal total (24), lo que arroja un volumen de distribución de agua accesible de 500 ml/kg de peso corporal. Sobre la base de estas suposiciones, se calculó que la tasa máxima de transaminación era de 0,043 μmol/ml por h.
Un producto adicional del metabolismo de la fenilalanina que se deriva, al menos en parte, del fenilpiruvato y que no se midió en el estudio de Langenbeck et al. (22) es la fenilacetilglutamina (PAG). Hay pruebas de que la PAG puede formarse a partir del fenilacetato, que se deriva del fenilpiruvato por descarboxilación oxidativa (25). También se ha propuesto que el fenilacetato y, por tanto, el PAG, pueden formarse a partir de la fenilalanina por una ruta que no implica la transaminación, sino que implica la descarboxilación a feniletilamina seguida de la oxidación de la amina a fenilacetato (26). Sin embargo, el hallazgo de que la cantidad de feniletilamina excretada en los pacientes con PKU es pequeña incluso después de bloquear la oxidación de la amina mediante la administración de un inhibidor de la amina oxidasa (27), indica que, como se ha comentado anteriormente (12), la descarboxilación de la fenilalanina es una vía cuantitativamente menor para el metabolismo de la fenilalanina, así como para la formación de PAG.
La cantidad de PAG excretada por individuos normales es de 250-500 mg/día; los pacientes con PKU excretan el doble de esa cantidad (28). Para calcular la cantidad de PAG formada a través de la vía de la transaminasa, se hizo la suposición conservadora de que sólo la cantidad «extra» excretada por los pacientes se deriva del fenilpiruvato. Tomando la cantidad extra media de PAG excretada como 350 mg/día y haciendo las mismas suposiciones señaladas anteriormente, esta excreción se traduce en una tasa de formación de PAG de 0,020 μmol/ml por h, con lo que la tasa de formación de todos los productos transaminados es de 0,063 μmol/ml por h.
Con el uso de este valor para Vmax, se utilizaron los resultados de la prueba de carga de fenilalanina realizada en pacientes con PKU clásica (21) para calcular un valor de 1.37 ± 0,14 mM (media ± SD, n = 3) para la Km de la fenilalanina transaminasa.
Debido a que en el presente análisis, las actividades de la HAP y la transaminasa se calculan en función de los niveles de fenilalanina en sangre, es importante que estos niveles reflejen los niveles tisulares del aminoácido. En este sentido, se ha informado de que los niveles de fenilalanina en el tejido hepático de un paciente con PKU (29), así como en el tejido hepático y renal de ratas hiperfenilalanémicas (30), son comparables a los niveles correspondientes en sangre.
El tercer término de la Ecuación 2, la tasa de degradación neta de proteínas, se estimó a partir de los datos de Waterlow y Jackson (31), mostrando que en el estado de ayuno, el estado bajo el cual se realiza la prueba de carga de fenilalanina, la descomposición neta de proteínas (es decir, la cantidad de proteína descompuesta menos la cantidad sintetizada) es igual a 0,30 g/kg de peso corporal por 12 h. Dado que el músculo esquelético constituye ≈40% de la masa corporal (24) y que el catabolismo proteico en este tejido desempeña un papel importante en la entrega de aminoácidos a la periferia, se tomó la degradación proteica en el músculo esquelético como el evento predominante en la degradación de proteínas que se produce durante el ayuno.
El músculo esquelético humano contiene ≈46 μmol de fenilalanina/g de tejido (32). Sobre la base de ese valor y de la constatación de que el músculo humano adulto contiene un 19,8% de proteínas (33), puede estimarse que el músculo contiene 232 μmol de fenilalanina/g de proteína muscular. Si este valor se toma como representativo de las reservas de proteínas corporales, indicaría que durante el período de ayuno se liberarían ≈70 μmol de fenilalanina/kg de peso corporal por 12 h. Sobre la base de las mismas suposiciones que las realizadas anteriormente para estimar la tasa de transaminación de la fenilalanina, este último valor se traduciría en una tasa horaria de degradación neta de proteínas (y de liberación de fenilalanina a partir de este proceso) de 0,012 μmol/ml por h. Dado que el sustrato para esta reacción, es decir, las reservas corporales de proteínas, probablemente se mantendría relativamente constante durante un breve período de ayuno, se supuso que la degradación de las proteínas seguía una cinética de orden cero.
Sustituyendo los valores estimados para las constantes cinéticas para las tres reacciones mostradas en la Ecuación 1 se obtiene la Ecuación 3: 
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La validez general de la Ecuación 3 puede evaluarse de varias maneras. En primer lugar, con el uso de la expresión para la velocidad de la reacción catalizada por HAP, incluyendo las constantes cinéticas mostradas en la ecuación, se calculó que la velocidad basal de la reacción de hidroxilación era de 0,010 μmol/ml por h. Este valor concuerda bien con los siguientes valores reportados para sujetos normales sobre la base de experimentos en los que se infundió a los sujetos con l-fenilalanina: 0,013 μmol/ml por h; 0,008 μmol/ml por h (34); 0,012 μmol/ml por h (5); 0,010 μmol/ml por h (6). En el último estudio se encontró un valor de 0,020 μmol/ml por h cuando se infundió a los sujetos con l-fenilalanina (6). Todas las tasas in vivo citadas para la conversión de fenilalanina en tirosina se comunicaron como μmol/h por kg. Se convirtieron a μmol/ml por h sobre la base de los mismos supuestos utilizados anteriormente, es decir, que el volumen de distribución de metabolitos como la fenilalanina es de 500 ml/kg de peso corporal. Estos resultados muestran que la tasa calculada de hidroxilación de la fenilalanina concuerda bien con las tasas determinadas experimentalmente.
Otra prueba de la validez del modelo consiste en calcular el nivel de fenilalanina en sangre en estado estacionario tanto para los sujetos de control como para los heterocigotos de la PKU que se supone que tienen el 50% de la actividad normal de la PAH, así como el t1/2 para la eliminación de una carga de fenilalanina (es decir, el tiempo necesario para que la concentración inicial de fenilalanina disminuya a la mitad de su valor original) de la sangre para estos dos grupos. El nivel de fenilalanina en estado estacionario para los controles, calculado a partir de la Ecuación 3 (estableciendo el término «-dPhe/dt» igual a cero y calculando la concentración de fenilalanina), es de 0,059 mM y el de los sujetos con un 50% de actividad residual de HAP es de 0,079 mM, 1,34 veces mayor que el nivel de control. Aunque el valor de 0,059 mM para los sujetos normales concuerda bien con el valor aceptado de 0,058 ± 0,015 mM (media y SD) (35), el valor de 0,079 mM para los heterocigotos, de los que se espera que tengan el 50% del nivel normal de HAP, parece ser demasiado bajo. La relación de los niveles de fenilalanina en sangre para los controles y para los heterocigotos obligados de PKU ha sido reportada en el rango de 1,57-1,61 (36-38) en lugar de la relación de 1,34 que fue predicha por el modelo.
Este valor calculado plantea la posibilidad de que los heterocigotos de PKU puedan tener menos del 50% de la actividad PAH de control. Sustituyendo un valor del 40% de la actividad PAH de control para los heterocigotos en la Ecuación 3 se obtiene una concentración de fenilalanina en estado estacionario de 0,093 mM; con el uso de este valor y el valor de 0,058 mM para los controles, se obtiene una relación de 1,60, que se aproxima al rango reportado para los heterocigotos y los controles (ver arriba). A este respecto, cabe señalar que la actividad residual de HAP en las muestras de biopsia de hígado encontradas para seis heterocigotos obligados a HPA osciló entre el 5,8 y el 31% de los valores de control (39). Estos resultados proporcionaron la primera indicación de que los heterocigotos HPA tienen significativamente menos del 50% de la actividad de control. Dos estudios posteriores más amplios de padres de pacientes con PKU coincidieron con estos resultados anteriores: un estudio informó de un valor medio del 29,3% de los controles (n = 9) (40) y otro informó de un valor medio del 28,1% (n = 8) (41).
El modelo también predice valores t1/2 para la eliminación de fenilalanina de la sangre tanto para normales como para heterocigotos que coinciden con los resultados clínicos reales. Para los normales, se obtiene un valor de 65 min, que es inferior al valor medio comunicado de 89 min, pero que se encuentra dentro del rango de 60-120 min (10). Para los heterocigotos con un 50 y un 40% de actividad residual de HAP, los valores t1/2 calculados a partir de la Ecuación 3 son 144 y 180 min, respectivamente, en comparación con un valor medio comunicado de 159 min.
Se ha hecho referencia anteriormente a un informe de dos pacientes con HPA cuya incapacidad para metabolizar la fenilalanina parecía ser el resultado de una deficiencia de transaminasa (11) y a las pruebas en contra de esta conclusión (12). El presente modelo proporciona una razón adicional para ver esta afirmación con escepticismo. La Fig. 2 muestra el curso temporal de la desaparición de 1 mM de fenilalanina del plasma de un sujeto de control (curva A) así como de uno que carece de la transaminasa pero con niveles normales de HAP (curva B). Como puede observarse, los dos índices son casi iguales, lo que hace extremadamente improbable que un HPA pronunciado pueda ser causado por la falta de transaminasa. La razón de la casi identidad de las dos tasas es que la tasa de desaparición de la fenilalanina en ausencia total de HAP (curva D) es muy pequeña, siendo la tasa inicial sólo el 2,6% de la de un control con niveles normales de HAP. La Fig. 2 (curva C) muestra también la tasa de eliminación de fenilalanina en un individuo con un 40% del nivel normal de HAP, un déficit de actividad de HAP que, como se ha comentado anteriormente, puede representar la media de los heterocigotos de la PKU.
Tasa calculada de eliminación de una carga de fenilalanina para los controles y para los individuos con diferentes genotipos. A, controles; B, sujeto con actividad de transaminasa nula; C, sujeto con un 40% de actividad de HAP de control; D, sujeto con un 0% de actividad de HAP de control.
Recientemente, los pacientes con PKU se clasificaron asignándolos a categorías de fenotipo sobre la base de su tolerancia a la fenilalanina en la dieta. Los pacientes con PKU clásica toleran menos de 20 mg/kg de fenilalanina al día para mantener sus niveles de fenilalanina en sangre en el nivel aceptado de 0,3 mM, los de «PKU moderada» toleran entre 20 y 25 mg/kg al día, y los de «PKU leve» toleran entre 25 y 50 mg/kg al día (42).
Para ver si estos valores de tolerancia a la fenilalanina en la dieta son coherentes con las predicciones hechas por la Ecuación 3, se asumió que la ingesta de la cantidad permitida de fenilalanina se dividía por igual en tres «comidas». Para los pacientes con PKU clásica con una ingesta de fenilalanina de 15 mg/kg al día, cada comida contendría 5 mg/kg al día y añadiría 0,06 μmol/ml al valor de referencia de 0,30 μmol/ml para un nivel total de fenilalanina en plasma de 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Sustituyendo este valor en la Ecuación 3 (asumiendo que la Vmax para un paciente con PKU clásica es igual a cero), -dPhe/dt es igual a 0,001 μmol/ml por h, es decir, a este nivel de fenilalanina, la velocidad de desaparición de la fenilalanina a través de la reacción de transaminación apenas supera la velocidad de entrada de la fenilalanina en el pool plasmático a través de la degradación proteica neta. Por lo tanto, la Ecuación 3 predice que estos pacientes con PKU podrían tolerar una ingesta de fenilalanina de 15 mg/kg por día.
Calculado de la misma manera, los pacientes con «PKU moderada» con una tolerancia a la fenilalanina en la dieta de 25 mg/kg por día requerirían una actividad de HAP residual igual al 15% de la del tipo salvaje para metabolizarla en 3.5 h. Del mismo modo, los pacientes con «PKU leve» con una tolerancia a la fenilalanina en la dieta de 50 mg/kg por día requerirían un nivel residual de PAH del 25% del nivel de tipo salvaje para metabolizar la fenilalanina añadida en aproximadamente 3,5 h.Estos resultados indican que la Ecuación 3 puede explicar la tolerancia a la fenilalanina dietética observada en estos diferentes grupos de pacientes.
Sería útil intentar correlacionar estas estimaciones de la actividad residual de la PAH para los pacientes con «PKU leve» y «PKU moderada» con la actividad residual de la hidroxilasa medida in vitro para las especies mutantes de PAH albergadas por los pacientes. Sin embargo, en la actualidad, este intento se ve obstaculizado porque hay demasiada dispersión en los datos in vitro. Así, se ha demostrado que varios pacientes clasificados como «PKU moderada» (42) albergan las siguientes tres formas mutantes de PAH (con sus actividades de PAH residuales in vitro expresadas como porcentaje de las actividades de tipo salvaje, mostradas entre paréntesis): L348V (25%), R261Q (30%, 47%) y R158Q (10%) (43). Se puede observar que estos valores varían en casi 5 veces. Como se ha discutido anteriormente (2, 43), en general, las estimaciones in vitro de la actividad residual de la hidoxilasa de los mutantes PAH tienden a ser más altas que las observadas en las biopsias de hígado. Al menos una de las razones de esta tendencia es que las actividades in vitro de la PAH se miden habitualmente utilizando concentraciones saturadas de fenilalanina y BH4, como se hizo con el mutante R261Q (44). Dada esta situación, es posible que las actividades PAH residuales estimadas con el uso de la Ecuación 3 puedan ser un mejor reflejo de las actividades in vivo que las medidas in vitro.
El presente modelo del metabolismo de la fenilalanina es relevante para la conclusión alcanzada por Thompson y sus colegas (45, 46), sobre la base de los resultados obtenidos por la infusión de sujetos con fenilalanina y tirosina marcadas con deuterio, de que los pacientes con PKU clásica tienen una actividad PAH «sustancial» que es igual a alrededor del 76% de la de los sujetos control. Esta sorprendente actividad de hidroxilación de la fenilalanina se atribuyó a la tirosina hidroxilasa (45). Como ya se ha comentado, los resultados resumidos en la Fig. 2 muestran que en ausencia de HAP, una dosis de fenilalanina se elimina de la sangre a menos del 3% de la tasa observada en los controles. El presente análisis no indica que exista una vía alternativa en los humanos que pueda eliminar grandes cantidades de fenilalanina. Recientemente, van Spronsen et al. (34) han señalado un posible problema metodológico con el método utilizado por Thompson y colaboradores.
En resumen, los resultados cuantitativos obtenidos con el modelo para el metabolismo de la fenilalanina son coherentes con los datos que reflejan indirectamente la actividad in vivo de la fenilalanina, como los niveles de fenilalanina en la sangre en estado estacionario, las tasas de eliminación (expresadas convencionalmente como valores t1/2) de la fenilalanina de la sangre después de una carga de fenilalanina, y la tolerancia dietética a la fenilalanina. El modelo tiene el potencial de estimar cuantitativamente la actividad residual de HAP a partir de cualquiera de estos valores, particularmente a partir de las tasas medidas de aclaramiento de una carga de fenilalanina. Los niveles residuales de HAP predichos o los valores derivados de ellos pueden ser útiles para tomar decisiones sobre cuán estricta debe ser la restricción dietética de fenilalanina para lograr el nivel deseado de fenilalanina en la sangre. La Tabla 1 resume los valores t1/2 y los niveles de fenilalanina en sangre en estado estacionario calculados a partir de la Ecuación 3 (asumiendo que no hay ingesta de fenilalanina durante el período de prueba) para diferentes niveles de actividad residual de HAP, así como valores comparables de datos clínicos relevantes.
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Niveles sanguíneos de fenilalanina en estado estacionario y valores t
para el aclaramiento de fenilalnina calculados a partir de la Ec. 3 para varios niveles de HAP
Notas a pie de página
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↵* A quien deben dirigirse las solicitudes de reimpresión. correo electrónico: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABREVIACIONES
HAP, fenilalanina hidroxilasa; PKU, fenilcetonuria; HPA, hiperfenilalaninemia; PAG, fenilacetilglutamina