Resultados y discusión
Dos vías para la oxidación del Pt en E. coli. Los estudios genéticos han demostrado que la enzima C-P liasa, codificada por el operón phn, es capaz de oxidar el Pt (26). Sin embargo, en un estudio reciente (9), nos sorprendió observar que algunos mutantes de E. coli phn seguían siendo capaces de oxidar Pt. El examen del genotipo de estas cepas sugirió que el locus phoA podría estar implicado en la oxidación del Pt. Para probar esta hipótesis directamente, examinamos las cepas de E. coli que diferían únicamente en los loci phn y phoA en cuanto a su capacidad para oxidar Pt, tal y como se demostró por su capacidad para crecer en medios con Pt como única fuente de P. Dado que el fosfato es necesario para el crecimiento, los organismos no pueden crecer en este medio a menos que tengan la capacidad de oxidar el Pt a fosfato. Las cepas que eran o bien phoA + o bien phn + crecieron en un medio con Pt (independientemente de si el otro locus estaba mutado), mientras que las cepas con mutaciones tanto en phn como en phoA no lo hicieron (Fig. 1). Por lo tanto, E. coli tiene dos vías para la oxidación del Pt: una que es dependiente de phn y otra que es dependiente de phoA.
En apoyo de esta hipótesis, detectamos la producción de H2 dependiente del Pt tanto in vitro como in vivo. Los ensayos in vitro se realizaron de forma aeróbica en viales sellados utilizando BAP altamente purificado. Después de la incubación, el espacio de cabeza fue analizado para H2, y la porción acuosa fue analizada para fosfato. Como se muestra en la Fig. 2B , se produjeron cantidades estequiométricas de fosfato y H2 a partir de Pt en presencia de BAP, mientras que no se produjo ni fosfato ni H2 en las reacciones de control que contenían BAP o Pt solo.
Los productos de la oxidación de Pt catalizada por BAP son fosfato y H2 molecular.(A) Se indican los espectros de resonancia magnética nuclear 31P desacoplados por protones y las posiciones de los picos para controles de 5 mM de Pt y 5 mM de fosfato, así como para una reacción de una noche que contenía inicialmente 5 mM de Pt más 500 μg de BAP purificado. En el espectro de la reacción enzimática son evidentes un pico de Pt sin reaccionar y un nuevo pico de fosfato, pero no se produjeron otros productos. El ligero cambio de posición del pico de fosfato entre el control y el producto de la reacción catalizada por el BAP se debe a pequeñas diferencias de pH: la adición de una solución madre de fosfato al ensayo aumentó la altura del pico de Pi pero no produjo picos adicionales. Los espectros acoplados a protones son completamente consistentes con esta interpretación (datos no mostrados). (B) La oxidación de Pt catalizada por BAP produce cantidades estequiométricas de fosfato y H2 molecular. Las reacciones in vitro que contenían los componentes indicados se incubaron durante la noche a 37°C en viales sellados. La atmósfera del espacio de cabeza se analizó para el H2 mediante cromatografía de gases con detección de conductividad térmica, mientras que la fase acuosa se analizó para el fosfato mediante el ensayo del verde de malaquita. Las reacciones (3 ml) se realizaron en 50 mM de Mops (pH 7,0) con 50 mM de Pt (pH 7,0) y 387 μg de BAP purificado, como se indica. Se realizaron controles por triplicado que contenían BAP o Pt solo, pero no se detectó ni fosfato ni H2 en estas condiciones. Los resultados in vivo muestran la cantidad de H2 producida durante el crecimiento de WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) en caldo de glucosa/Mops al 0,4% que contiene 2,5 μmol de la fuente de P indicada. Dado que este nivel de P (500 μM) es limitante para el crecimiento, se espera que la fuente de P sea completamente asimilada cuando los cultivos alcancen la saturación. Tras el crecimiento nocturno a 37°C en viales sellados, se analizó el espacio de cabeza para el H2 mediante cromatografía de gases con detección de conductividad térmica. Tanto los experimentos in vitro como in vivo se llevaron a cabo de forma aeróbica (es decir, el O2 estaba presente durante la oxidación del Pt).
La medición del H2 in vivo es complicada por el hecho de que E. coli tiene múltiples hidrogenasas que pueden tanto producir como consumir H2. Para sortear este problema, construimos un mutante ΔhypABCDE, que no puede producir ninguna hidrogenasa activa debido a su incapacidad para madurar las proteínas precursoras (32). El mutante hyp, cultivado aeróbicamente en tubos sellados, también produjo cantidades aproximadamente estequiométricas de H2 en cultivos crecidos con niveles limitantes de Pt, mientras que no se detectó H2 en cultivos crecidos con niveles limitantes de fosfato o del éster de fosfato fosfoserina (Fig. 2B ).
La oxidación de Pt no es una característica común de todas las fosfatasas alcalinas. La oxidación eficiente de Pt parece ser una característica única de la fosfatasa alcalina de E. coli. Ni Bacillus subtilis, que se sabe que produce múltiples fosfatasas altamente activas (33), ni P. stutzeri, que se sabe que produce una fosfatasa distinta de la BAP (en cepas que carecen del sistema de deshidrogenasa de Pt) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson, y W.W.M., datos no publicados), pueden utilizar Pt como única fuente de P (Fig. 3A ), aunque ambos organismos crecen en medios con fosfoserina como única fuente de P (datos no mostrados). Por lo tanto, las fosfatasas producidas por estos organismos son incapaces de oxidar el Pt a tasas que son suficientes para apoyar el crecimiento. También ensayamos preparaciones comerciales de fosfatasa intestinal de ternera (CIP) y fosfatasa alcalina de camarón (SAP) para comprobar su capacidad de producir fosfato a partir de Pt (Fig. 3B ). Aunque las fosfatasas eucariotas produjeron pequeñas cantidades de fosfato tras la incubación de una noche, sólo la BAP de E. coli fue capaz de catalizar la reacción a tasas significativas. Este hallazgo es especialmente sorprendente porque las enzimas eucariotas son en realidad fosfatasas mucho mejores, con actividades específicas hasta 40 veces superiores a la BAP (27). Todas estas enzimas comparten una homología significativa (25-35% de identidad) con la BAP de E. coli; además, la mayoría de los residuos del sitio activo, incluida la Ser-102 (que forma un intermediario fosfoenzimático covalente durante la reacción de fosfatasa), están conservados (27).
La oxidación de Pt es única para la fosfatasa alcalina de E. coli. (A) Se probó la capacidad de B. subtilis y P. stutzeri para oxidar Pt, como se demostró por el crecimiento en medios con Pt como única fuente de P, como se describe en la Fig. 1. Ninguno de los dos organismos creció en el medio de Pt, mientras que ambos crecieron en el medio de fosfato. Así, a pesar de que ambos organismos tienen fosfatasas activas, ninguno puede oxidar el Pt a tasas suficientes para apoyar el crecimiento. El P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) contiene mutaciones que eliminan las dos vías de oxidación de Pt caracterizadas de este organismo pero que no afectan a la expresión de la fosfatasa (9, 10). (B) La BAP (fosfatasa alcalina de E. coli), la SAP (fosfatasa alcalina de camarón; Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) y la CIP (fosfatasa intestinal de ternera; Sigma) se ensayaron para la oxidación del Pt como se ha descrito anteriormente. Se utilizaron 56 μg de la fosfatasa indicada en cada ensayo, lo que corresponde a 3 unidades de BAP, 32 de SAP y 65 de CIP de fosfatasa, medidas por hidrólisis de pNPP. A pesar de las actividades de fosfatasa mucho más altas de las enzimas eucariotas, sólo la BAP catalizó la oxidación de Pt a tasas significativas. El promedio de dos ensayos se traza.
Parece ser plausible que la oxidación de Pt sea catalizada por BAP por un mecanismo similar al utilizado para la hidrólisis de ésteres de fosfato (Fig. 4A ). En consecuencia, el Pt puede ser hidrolizado por el BAP con el anión hidruro como grupo formal de salida. En apoyo de esta idea, un mutante de phoA con el residuo Ser-102 del sitio activo cambiado a alanina es incapaz de utilizar el Pt como única fuente de P, indicando que este aminoácido es necesario para la hidrólisis del éster de fosfato (27) y para la oxidación del Pt (Fig. 4B ). Aunque la transferencia directa de hidruros desde un sustrato a un protón acuoso no tiene precedentes bioquímicos, esta reacción es termodinámicamente razonable dado el fuerte potencial reductor del par fosfato-Pt (E o′ = -0,650 V). Así, la reacción de producción de H bastante favorable: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (calculado a partir de los potenciales redox en la ref. 34). Si el modelo hidrolítico para la oxidación del Pt resulta ser correcto, sería una reacción enzimática muy inusual. Los estudios han demostrado que la BAP también es capaz de hidrolizar fosfodiésteres (35), fosfoamidas (36), ésteres de sulfato (37) y tiofosfato (38). Sin embargo, estas reacciones se producen a velocidades considerablemente más lentas que las de la reacción de hidrólisis de Pt, a pesar de que implican grupos salientes mucho mejores. Además, no son reacciones redox. La reacción análoga que implica la hidrólisis de ácidos alquilfosfónicos no es catalizada por BAP, como se muestra tanto bioquímicamente (39) como por la incapacidad de las cepas de Δphn para utilizar estos compuestos como únicas fuentes de P (13).
La oxidación del P por el BAP puede ocurrir mediante hidrólisis con el anión hidruro como grupo saliente. (A) El mecanismo químico para la hidrólisis del éster de fosfato por BAP implica el ataque nucleofílico de un residuo de serina activado (Ser-102) sobre el éster de fosfato para formar un intermedio enzimático de fosfoserina. El grupo saliente del alcóxido adquiere rápidamente un protón de la solución para formar el alcohol correspondiente. Parece probable que la oxidación del Pt se produzca mediante un mecanismo similar con el anión hidruro como grupo saliente. (B) El papel de Ser-102 en la oxidación del Pt se comprobó examinando si un mutante portador de una mutación Ser-102-Ala en el gen phoA podía crecer en medios de Pt, como se describe en la Fig. 1. El mutante no pudo crecer en Pt. El mutante no crecía en medio Pt, lo que demostraba la necesidad del sitio activo Ser-102 en la oxidación del Pt. La cepa huésped fue BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 y WM3611 llevan integrantes de copia única de los plásmidos pKY1 y pKY2, que codifican el gen phoA de tipo salvaje (phoA+) o el mutante phoA-S102A (Ser-102-Ala), respectivamente.
La deshidrogenasa de Pt (PtxD) ha sido la única enzima caracterizada in vitro que ha demostrado catalizar la oxidación del Pt (11). Aunque los detalles de la reacción BAP aún no se han dilucidado, los mecanismos químicos de las dos enzimas son claramente distintos. Mientras que la PtxD requiere NAD como aceptor de electrones para la reacción redox, la reacción catalizada por la BAP no requiere aceptores de electrones exógenos, sino que aprovecha la gran fuerza termodinámica de la reacción para producir un producto altamente reducido (H2) a partir del agua en una reacción esencialmente irreversible (K eq calculado = 1,1 × 108). Todas las demás reacciones conocidas de producción de H2 operan mucho más cerca del equilibrio químico y suelen ser reversibles. Además, todas las demás hidrogenasas conocidas contienen Fe o Ni, o ambos, en sus sitios activos (40). Esta observación incluye la llamada «libre de metales» que forma H2, la metileno tetrahidrometanopterina deshidrogenasa de las arqueas metanogénicas, que ahora se sabe que también contiene Fe (41). En cambio, la BAP no contiene metales redox activos, aunque tanto el Zn como el Mg son necesarios para la actividad hidrolítica (27). El tratamiento de la BAP con quelantes inhibe la oxidación del Pt, lo que sugiere que los metales desempeñan un papel en la reacción del Pt (datos no mostrados).
Por último, los datos in vivo presentados aquí sugieren que la reacción de oxidación del Pt es biológicamente relevante. La observación de que muchas bacterias poseen enzimas dedicadas a la oxidación del Pt demuestra que el rasgo está bajo una fuerte presión selectiva en las poblaciones microbianas (4, 5, 9, 42). Teniendo en cuenta este hecho, es interesante observar que, aunque las enzimas eucariotas son mucho mejores fosfatasas, son incapaces de oxidar el Pt. Esta observación plantea la posibilidad de que la BAP de E. coli no haya evolucionado para ser la fosfatasa más eficiente, sino para ser una fosfatasa con capacidad de hidrolizar Pt. Esta idea es coherente con la curiosa observación de que la BAP de E. coli se expresa en gran medida (hasta el 6% de la proteína total de la célula) en condiciones de inanición de fosfato (28). La explicación tradicional para este fenómeno es que algún sustrato desconocido de BAP debe ser pobremente hidrolizado y, por lo tanto, requerir cantidades masivas de enzima para soportar tasas de crecimiento competitivas. Sin embargo, como hay poca diferencia en las tasas de hidrólisis medidas para una amplia variedad de sustratos de ésteres de fosfato (39, 43), parece poco probable que este sustrato pobre pueda ser un éster de fosfato. Por el contrario, la tasa de hidrólisis de Pt es sustancialmente menor que la tasa de hidrólisis de ésteres de fosfato, lo que sugiere que el Pt puede ser el sustrato que explica el nivel extremo de expresión de phoA observado en E. coli carente de fosfato.
Claramente, muchos detalles de la reacción de BAP con Pt quedan por dilucidar. Es probable que el estudio adicional de esta reacción única contribuya no sólo a nuestra comprensión de la química redox del P y de las reacciones de transferencia de fosforilo, sino también a nuestro conocimiento de la transferencia de hidruros, las reacciones de producción de H2 y el papel de los compuestos de P reducidos en la naturaleza.