Abstrakt
Signalizace AGE/RAGE je dobře prostudovanou kaskádou u mnoha různých chorobných stavů, zejména u diabetu. Vzhledem ke komplexní povaze receptoru a mnoha vzájemně se křížícím drahám není mechanismus signalizace AGE/RAGE stále dobře pochopen. Cílem tohoto přehledu je upozornit na klíčové oblasti AGE/RAGE zprostředkované vaskulární kalcifikace jako komplikace diabetu. Signalizace AGE/RAGE silně ovlivňuje buněčné i systémové reakce na zvýšení proteinů kostní matrix prostřednictvím signálních drah PKC, p38 MAPK, fetuin-A, TGF-β, NFκB a ERK1/2 jak v podmínkách hyperglykémie, tak kalcifikace. Bylo prokázáno, že signalizace AGE/RAGE zvyšuje oxidační stres a podporuje tak cévní kalcifikaci zprostředkovanou diabetem prostřednictvím aktivace Nox-1 a snížené exprese SOD-1. Signalizace AGE/RAGE u cévní kalcifikace zprostředkované diabetem byla také přičítána zvýšenému oxidačnímu stresu, který má za následek fenotypový přechod VSMC na buňky podobné osteoblastům při kalcifikaci vyvolané AGEs. Výzkumníci zjistili, že farmakologické látky a některé antioxidanty snižují úroveň ukládání vápníku při AGEs indukované kalcifikaci cév zprostředkované diabetem. Pochopení role, kterou hraje signální kaskáda AGE/RAGE při kalcifikaci cév zprostředkované diabetem, umožní farmakologickou intervenci ke snížení závažnosti této diabetické komplikace.
1. Úvod
Diabetes mellitus je skupina onemocnění charakterizovaných zvýšenou hladinou glukózy v krvi neboli hyperglykémií, která je důsledkem neschopnosti organismu produkovat a/nebo využívat hormon inzulin. Diabetes mellitus I. typu je spojen s dysfunkcí β buněk pankreatu, která má za následek ztrátu produkce inzulinu, zatímco diabetes mellitus II. typu je způsoben dysfunkcí inzulinového receptoru, při níž je signalizace inzulinového receptoru oddělena od příjmu glukózy. Diabetes mellitus je ve Spojených státech velmi rozšířený, s diabetem žije přibližně 29 milionů lidí, což představuje 9,3 % populace . Uvádí se, že úmrtnost na kardiovaskulární onemocnění u jedince staršího 18 let s diabetem byla přibližně 1,7krát vyšší než u běžné populace . Zvýšená úmrtnost na kardiovaskulární onemocnění u diabetiků ukazuje na závažnost komplikací, které mohou vzniknout v důsledku této patologie. Proto je nezbytné pochopit souvislost mezi kardiovaskulárním onemocněním a diabetem .
2. Diabetes II. typu a vaskulární kalcifikace
Diabetes II. typu je silně spojován s vaskulární kalcifikací prostřednictvím několika různých mechanismů, z nichž některé zahrnují oxidativní stres, hyperglykémii, hyperkalémii a hyperkalcémii, přičemž oxidativní stres je hlavním předmětem tohoto přehledu . Cévní kalcifikace je popisována jako tvrdnutí mediální vrstvy tepny prostřednictvím ukládání minerálů hydroxyapatitu do extracelulární matrix . Tento proces, který byl dříve považován za pasivní a spojený se stárnutím, se nyní ukázal jako přísně regulovaný proces zprostředkovaný buňkami . Během vaskulární kalcifikace kostní morfogenetický protein-2 (BMP-2) aktivuje core binding factor alfa-1 (CBFA-1, známý také jako RunX2), který působí jako primární transkripční regulátor zrání osteoblastů v kosti . CBFA-1 také reguluje produkci osteoblastových proteinů v buňkách hladkého svalstva cév (VSMC), což pravděpodobně způsobuje fenotypový přepínač VSMC na fenotyp podobný osteoblastům . Bylo prokázáno, že alkalická fosfatáza (ALP) a kostní sialoprotein (BSP) jsou časnými markery aktivity osteoblastů, zatímco markery, jako je osteopontin (OPN) a osteokalcin, jsou regulovány v pozdní fázi procesu kalcifikace . Jejich primární funkcí je zvyšovat tvorbu a ukládání hydroxyapatitu, který se skládá z kolagenu typu I a dalších nekolagenních proteinů . ALP je primárně indikována při tvorbě kostí a je zodpovědná za štěpení pyrofosfátu na fosfát, čímž podporuje ukládání hydroxyapatitu a mineralizaci v kosti . BSP je zodpovědná za nukleaci hydroxyapatitového minerálu . Podobně jako ALP je i OPN spojen s ukládáním hydroxyapatitu a může sloužit jako mediátor buněčné vazby a signalizace . Velikost a tvar hydroxyapatitu jsou zprostředkovány osteokalcinem prostřednictvím mechanismu závislého na vitaminu K . Celkově tyto údaje ukazují potenciál pro podporu tvorby kosti v živém systému a vědci využili tyto znalosti proteinů kostní matrix k pochopení základních mechanismů vaskulární kalcifikace a diabetu II. typu.
V sérii studií provedených Chenem a spol. byly analyzovány tepny odebrané diabetickým a nediabetickým pacientům za účelem stanovení množství vápníku, OPN, ALP, kolagenu typu I a BSP. S výjimkou BSP byly všechny zkoumané proteiny kostní matrix v důsledku diabetu významně zvýšeny . Experimenty in vitro s použitím buněk hladkého svalstva hovězích cév (BVSMC) kultivovaných v euglykemických (normální glukóza) a hyperglykemických podmínkách ukázaly, že hladiny CBFA1, ALP a osteokalcinu byly významně vyšší u buněk kultivovaných v médiu s vysokým obsahem glukózy. Kromě toho bylo ukládání vápníku také významně vyšší v médiích s vysokou hladinou glukózy než v médiích s normální hladinou glukózy a tento trend byl pozorován i při doplnění obou typů podmínek růstu o kalcifikační média. Kalcifikační média obsahují zvýšené množství anorganického fosfátu, který podporuje kalcifikaci prostřednictvím využití buňkami, které potřebují k udržení homeostázy. Pro určení signálních mechanismů zodpovědných za zvýšenou expresi proteinů kostní matrix byly BVSMC vystaveny vysokým hladinám glukózy a aktivita proteinkinázy C (PKC) byla farmakologicky inhibována jak v normálních buňkách, tak v buňkách ošetřených vysokou hladinou glukózy. PKC byla vybrána jako signální dráha, na kterou se zaměříme, vzhledem k její předurčené roli v buněčných reakcích na diabetes a hyperglykémii . V důsledku toho došlo k výraznému snížení exprese proteinů kostní matrix, zatímco u buněk ošetřených normální glukózou nedošlo k žádné výrazné změně v expresi proteinů. Tato studie rovněž prokázala zvýšenou sekreci BMP-2 z BVSMC kultivovaných v médiu s vysokým obsahem glukózy. Celkově Chen et al. dospěli k závěru, že hyperglykemické podmínky, pozorované u diabetu, podporují upregulaci proteinů kostní matrix a kalcifikaci cév . Podpůrné studie Moriho et al. prokázaly, že OPN je v diabetických krysích VSMC upregulován a aktivován podobnou cestou zprostředkovanou PKC. Western blotting potvrdil, že inhibice PKC vedla ke znatelnému snížení exprese proteinu OPN . Souhrnně tyto studie prokázaly nejen převahu exprese proteinů kostní matrix v buňkách hladkého svalstva cév, ale také roli PKC v cévní kalcifikaci zprostředkované diabetem.
3. Cévní kalcifikace a signalizace AGE-RAGE
Kromě zvýšené exprese proteinů kostní matrix ve VSMC během léčby diabetiků a kalcifikace studie také ukázaly, že pokročilé konečné produkty glykace (AGE) a jejich receptory (RAGE) hrají roli v cévní kalcifikaci . Bylo prokázáno, že pacienti s diabetem II. typu mají výrazně vyšší koncentraci AGEs než nediabetická populace . AGEs vznikají v průběhu života v důsledku zvýšené cirkulace glukózy a dalších redukujících cukrů, jako je galaktóza a fruktóza, které reagují s aminoskupinami bílkovin za vzniku Schiffových bází, které buď následují polyolovou cestu za vzniku AGEs, nebo jsou degradovány . Tyto konečné produkty glykace interagují s RAGE, což jsou transmembránové proteiny, které patří do superrodiny imunoglobulinů. RAGE jsou regulovány v reakci na zvýšené hladiny cirkulujících AGE . Po navázání AGE-RAGE působí RAGE prostřednictvím PKC-ζ a spouští následnou aktivaci signální kaskády, která funguje prostřednictvím p38 mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), transformujícího růstového faktoru β (TGF-β) a jaderného faktoru κB (NFκB) . Suga et al. prokázali, že aktivace signalizace AGE-RAGE v potkaních VSMC snižuje expresi genových markerů VSMC, jako je hladký sval-myozinový těžký řetězec (SM-MHC) a hladký sval 22α (SM22α) . Tato downregulace markerů VSMC naznačuje možné fenotypové přepnutí VSMC na fenotyp podobný osteoblastům . To podporují i nálezy z lidských VSMC (HVSMC), kde aktivace RAGE zvýšila expresi mRNA a aktivitu ALP, proteinu kostní matrix, což naznačuje roli signalizace RAGE při kalcifikaci cév . Tyto studie prokázaly některé základní role RAGE při kalcifikaci VSMC prostřednictvím signalizace PKC-ζ, zvýšené exprese ALP a snížené exprese genových markerů VSMC.
Ve studiích provedených Tanikawou a kol. pomocí modelu kalcifikace HVSMC in vitro zvýšení hladiny AGE významně zvýšilo množství ukládání vápníku po 7 a 14 dnech ve srovnání se vzorky ošetřenými BSA a kontrolními vzorky . Kromě toho byla také významně zvýšena exprese mRNA CBFA-1 (RunX2), aktivita ALP a hladina proteinu osteokalcinu. Tyto údaje společně naznačují, že léčba AGE podporuje u HVSMC fenotyp podobný osteoblastům. Toto přepnutí fenotypu nebylo závislé na kalcifikačním médiu, protože podobné výsledky byly zjištěny při použití HVSMC pěstovaných s kalcifikačním médiem a bez něj . Exprese osteoblastových proteinů ve VSMC může souviset s aktivitou p38 MAPK, neboť Tanikawa et al. zjistili, že při zvýšené expozici AGE se aktivace p38 MAPK zvyšuje. Naopak při utlumení signalizace RAGE se aktivace p38 MAPK snížila a změny v p38 MAPK korelovaly se snížením hladiny aktivity ALP navzdory kalcifikaci vyvolané AGE . V podobné studii Hu et al. se ukázalo, že p38 MAPK je nezbytná pro diferenciaci osteoblastů v buňkách MC3T3-E1. Farmakologická inhibice p38 MAPK vedla ke snížení aktivity ALP, čímž prokázala, že p38 MAPK je nezbytná pro expresi ALP v buňkách podobných osteoblastům . Aktivita ALP tedy může být přímo ovlivněna jak zvýšenou expozicí AGE, tak zvýšenou signalizací kaskády RAGE prostřednictvím p38 MAPK. Tento vztah naznačuje, že p38 MAPK hraje klíčovou roli v dráze AGE-RAGE při vaskulární kalcifikaci zprostředkované diabetem .
Zatímco tato zjištění ukazují význam dráhy AGE-RAGE při vaskulární kalcifikaci zprostředkované diabetem, Ren et al. prokázali, že AGE také významně zvyšují intracelulární hladiny vápníku v krysích VSMC . Bylo zjištěno, že hladiny mRNA ALP a OPN byly významně zvýšeny po 24hodinovém působení glykovaného albuminu (AGE-BSA). Vzhledem ke zvýšení ALP a OPN při působení AGE-BSA skupina rovněž prokázala, že v krysích VSMC došlo k upregulaci RAGE. Při inkubaci s neutralizační protilátkou vůči RAGE se snížilo množství vápníku a exprese ALP. Pozorované změny potvrdily, že RAGE zprostředkovává kalcifikaci VSMC vyvolanou AGE . Wei et al. prokázali, že diabetes urychluje kalcifikaci aorty u samců potkanů Wistar . Zvířatům byl podáván streptozotocin (STZ) k navození diabetu a poté jim byl podáván vitamin D3 a nikotin (VDN) k navození vaskulární kalcifikace. von Kossa barvení umožnilo vizualizaci vápenatých částic v odstraněné aortální tkáni a ve vybraném řezu tkáně byly nalezeny vápenaté částice. Western blot analýza ukázala významné zvýšení exprese ALP a hladiny AGEs byly rovněž zvýšeny u zvířat léčených diabetem a VDN . Je důležité zdůraznit, že zatímco signalizace AGE-RAGE může přímo zprostředkovávat kalcifikaci cév u diabetu, signalizace AGE-RAGE může mít na tuto diabetickou komplikaci vliv i nepřímo.
4. V případě diabetu je možné, že signalizace AGE-RAGE může přímo ovlivňovat kalcifikaci cév. Role fetuinu-A v cévní kalcifikaci a signalizaci RAGE
Sérový protein -Heremans-Schmidův glykoprotein (Ahsg nebo fetuin-A), systémově cirkulující glykoprotein, se podílí na inzulinové rezistenci u pacientů s diabetem II. typu . Údaje o pacientech ukázaly, že vysoké hladiny fetuinu-A v séru jsou ukazatelem hyperglykémie u diabetiků II. typu. Fetuin-A také bránil příjmu inzulinu prostřednictvím inhibice inzulinového receptoru autofosforylovat protein substrát-1 inzulinového receptoru, který je klíčový pro signální dráhu inzulinového receptoru . Souhrnně tyto studie odhalily, že fetuin-A hraje roli v inzulínové rezistenci u diabetu II. typu, což může vést k dalšímu zhoršení hyperglykémie a dalších diabetických komplikací. Je zajímavé, že zvýšená hladina vaskulární kalcifikace byla prokázána nejen u diabetu II. typu, ale také u pacientů s chronickým onemocněním ledvin (CKD) . V tomto případě bylo prokázáno, že cévní kalcifikace podporuje zánětlivou i oxidativní stresovou reakci, která ji umocňuje jako rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění. Fetuin-A je uvolňován játry, aby fungoval jako protein akutní fáze ve vrozeném imunitním systému, kde funguje na podporu protizánětlivých a antioxidačních stresových reakcí, aby inhiboval nadměrně exprimované zánětlivé molekuly.
Naopak fetuin-A může také vyvolat vrozenou imunitní reakci vyvolanou částečně toll-like receptory (TLR). Tento mechanismus může být aktivován volnými mastnými kyselinami (FFA) a vyvolat prozánětlivou odpověď . Pal et al. ukázali, že fetuin-A může působit jako ligand k TLR-4 a stimulovat FFA indukovanou inzulinovou rezistenci v adipocytech . Kromě podpory inzulinové rezistence u diabetiků II. typu může fetuin-A také inhibovat alternativní ligand RAGE, high mobility group box-1 (HMGB1), který je zodpovědný za uvolňování a nábor několika cytokinů, adhezních molekul a chemokinů. Bylo prokázáno, že aktivace signální kaskády RAGE je zodpovědná za expresi tumor nekrotizujícího faktoru (TNF) a interleukinu-1 (IL-1) zprostředkovanou HMGB1 . Znepokojující je, že inhibice HMGB1 fetuinem-A by mohla vytvořit prostředí pro přednostní výběr a vazbu AGE pro aktivaci kaskády RAGE. Na základě údajů získaných ze vzorků pacientů s CKD Janda et al. prokázali, že zvýšená hladina fetuinu-A v séru je pozitivním ukazatelem zvýšeného ukládání AGEs v tepnách, což naznačuje, že fetuin-A může nepřímo ovlivňovat cestu AGE/RAGE, zejména v přítomnosti zánětlivých molekul.
Fetuin-A (Ahsg) má vysokou afinitu ke krystalům hydroxyapatitu, které se nacházejí v místech cévní kalcifikace, jako jsou kosti a zuby . Ketteler et al. využili pacienty s CKD na hemodialýze a korelovali kardiovaskulární mortalitu se snížením hladiny fetuinu-A a zvýšenou vaskulární kalcifikací, což naznačuje, že fetuin-A působí jako inhibitor kalcifikace . Studie využívající model myší s deficitem fetuinu-A, které byly citlivé na kalcifikaci (DBA/2-Ahsg-/-), určily, že tento glykoprotein je inhibitorem kalcifikace . Rentgenové snímky kostí a von Kossovo barvení plic, srdce, ledvin a kůže odhalily vizuální zvýšení ukládání fosforu a vápníku v jednotlivých typech tkání. Ze zvířat DBA/2-Ahsg-/- bylo odebráno krevní sérum k provedení testu srážení základního fosforečnanu vápenatého (BCP) in vitro. Fetuin-A snížil množství precipitátu BCP v séru, což naznačuje, že fetuin-A může inhibovat tvorbu depozit BCP . Ve stejné výzkumné skupině Heiss a kol. použili elektronovou mikroskopii a dynamický rozptyl světla ke stanovení strukturních charakteristik fetuinu-A, který se komplexuje s BCP za vzniku kalciproteinových částic. Další studie s použitím purifikovaného fetuinu-A inkubovaného s BCP in vitro vedly ke změně struktury BCP z tuhé na křehkou . Tato pozorovaná strukturální změna byla pozorována i u jiných materiálů na bázi vápníku, jako jsou nanočástice CaCO3 .
Vztah mezi fetuinem-A, BCP a kalcifikovanými VSMC byl stanoven pomocí modelového systému HVSMC in vitro a in vivo. Reynolds et al. prokázali, že fetuin-A byl lokalizován v matrixových vezikulách kalcifikovaných HVSMCs v mediální vrstvě tepny . Tyto kalcifikované HVSMC byly ošetřeny fetuinem-A, který inhiboval ukládání vápníku a inkorporaci vápníku v závislosti na dávce a buněčným způsobem. Bylo prokázáno, že VSMC podléhají vezikulární a apoptotickými tělísky zprostředkované vaskulární kalcifikaci . Mikroskopie a western blotting odhalily, že apoptóza HVSMC byla fetuinem-A inhibována. Kalcifikace uvolněných matrixových vezikul a apoptotických tělísek byla kvantifikována pomocí energeticky disperzní rentgenové analýzy a ukázala, že fetuin-A rovněž inhibuje kalcifikaci těchto uvolněných buněčných částic. V téže studii bylo prokázáno, že fetuin-A je inhibitorem kalcifikace HVSMC zprostředkované matrixovými vezikuly a apoptotickými tělísky . V podobných studiích Moe et al. bylo prokázáno, že fetuin-A je inhibitorem kalcifikace v BVSMC . Souhrnně tyto údaje ukazují, že fetuin-A je inhibitorem kalcifikace.
5. Signalizace AGE-RAGE a oxidativní stres při kalcifikaci cév
Bylo prokázáno, že signalizační kaskáda AGE/RAGE se podobá zpětnovazební smyčce, při níž vznikají následky, jako je zvýšená fibróza, zvýšená exprese RAGE a zvýšení oxidativních stresorů . Oxidační stres vyvolaný zvýšeným množstvím reaktivních forem kyslíku (ROS) může narušit řadu intracelulárních struktur, jako jsou buněčné membrány, proteiny, lipidy a DNA. Produkty ROS, jako je peroxid vodíku, superoxidové anionty, hydroxylové radikály a oxid dusnatý, jsou generovány mitochondriálními oxidázami, NADPH oxidázami (Nox) a syntázami oxidu dusnatého . Aktivace RAGE vede ke zvýšené produkci ROS stimulací specifických signálních kaskád, jako jsou TGF-β, NF-κB a Nox-1 . Ve studii provedené Wei et al. byly k posouzení oxidačního stresu a schopnosti iniciovat kompenzační mechanismus oxidačního stresu u zvířecích modelů cévní kalcifikace zprostředkované diabetem použity koncentrace malondialdehydu (MDA) a aktivita Cu/Zn superoxiddismutázy (SOD-1). U diabetických zvířat s VDN indukovanou vaskulární kalcifikací došlo k významnému zvýšení obsahu MDA a významnému snížení hladiny aktivity SOD ve srovnání s diabetickou skupinou. Když byly izolované VSMC ošetřeny zvyšujícími se hladinami AGE, došlo ke zvýšení hladiny aktivity ALP, produkce ROS zprostředkované Nox-1 a exprese RAGE. Inhibice exprese RAGE následně snížila aktivitu ALP, obsah vápníku a produkci proteinu Nox-1 při současném zvýšení hladiny SOD-1. Celkově tyto studie prokázaly, že buněčné izoláty z modelového diabetu s modelem cévní kalcifikace zprostředkované VDN reagovaly na léčbu AGE, o čemž svědčí výrazně zvýšené hladiny ALP, ROS, Nox-1 a proteinu RAGE ve srovnání s pouze diabetickými zvířaty . Brodeur a kol. využili podobný zvířecí model ke zjištění, zda lze AGE v rámci systému in vivo snížit poté, co došlo ke kalcifikaci cév zprostředkované diabetem . Pyridoxamin (PYR), inhibitor AGE, byl podáván jako preventivní léčba před kalcifikací, zatímco alagebrium (ALA), rozbíječ AGE, bylo podáváno jako terapeutická léčba po kalcifikaci. V těchto studiích pouze ALA umožnil významné snížení počtu AGE a obsahu vápníku měřeného ve svalových tepnách, jako je stehenní tepna, ale ne ve větších vodivých tepnách, jako je aorta. PYR snížila celkový obsah AGE a vápníku, ale ve studovaných tkáních to nebylo významné. Rozdíl v účinnosti obou léčebných postupů by mohl být způsoben mechanismy působení; PYR působí jako prevence AGE, zatímco ALA působí jako rozbíječ příčných vazeb AGE. Byla také testována účinnost několika antioxidačních terapií, jako je kyselina alfa-lipiová, 4-hydroxy tempol a apocynin. Léčba apocyninem vedla k významnému snížení ukládání vápníku ve zvířecím modelu cévní kalcifikace způsobené diabetem. Brodeur et al. prokázali, že snížení vápníku prostřednictvím cílené antioxidační léčby ROS je proveditelnější léčbou v modelu vaskulární kalcifikace in vivo . Souhrnně tyto studie ukazují, že kaskáda AGE/RAGE je schopna zprostředkovat vaskulární kalcifikaci prostřednictvím mechanismů oxidačního stresu a terapeutická léčba omezující produkci ROS by mohla poskytnout schůdnější alternativu k minimalizaci vaskulární kalcifikace.
Další signalizační kaskáda ROS aktivovaná AGE je transformující růstový faktor- (TGF-) β. Ve studii Li et al. když byly VSMC ošetřeny AGE, členové signalizační kaskády AGE/RAGE (tj, p38 MAPK a ERK1/2) byly po aktivaci RAGE fosforylovány . Signalizace TGF-β navíc vedla k fosforylaci jeho rodiny mediátorů, Smads, které slouží jako transkripční modulátory . Bylo zjištěno, že tyto změny jsou závislé na TGF-β. Analýza Western blot odhalila, že při snížení exprese RAGE byla inhibována i fosforylace Smad 2, což ukazuje na kaskádu AGE/RAGE při aktivaci Smad a signalizaci TGF-β . Jelikož se AGE hromadí v extracelulární matrix (ECM), je důležité poznamenat, že zvýšení TGF-β se podílí na fibróze v rámci onemocnění . Fibróza je obvykle spojena se zvýšením kolagenu typu I a Li et al. využili analýzu Western blot, aby prokázali, že AGEs vyvolávají zvýšenou produkci kolagenu typu I, která byla inhibována blokádou signalizace p38 MAPK a ERK1/2 . Tyto údaje umožňují učinit závěr, že signalizace AGE/RAGE hraje roli při udržování a regulaci ECM u diabetu a že AGE indukují TGF-β zprostředkovaně prostřednictvím RAGE .
Bylo také prokázáno, že AGE zvyšují aktivitu NFκB prostřednictvím signalizace RAGE ve VSMC. Studie prokázaly, že VSMC si v tepně udrží poddajný, kontraktilní fenotyp; zvýšení signalizace NFκB však tento fenotyp naruší, což má za následek zvýšenou rigiditu a tuhost běžně spojenou s kardiovaskulárními diabetickými komplikacemi . Simard a spol. ošetřili VSMC potkaní aorty (buňky A7r5) glykovaným lidským sérovým albuminem (AGE-HSA) a pomocí exprese GFP pozorovali významně zvýšenou aktivitu NFκB. Western blot analýza ukázala, že aktivace ERK1/2 byla při léčbě AGE-HSA významně zvýšena a aktivace AKT byla mírně zvýšena. Obě tyto dráhy aktivují NFκB, což by umožnilo učinit závěr, že signalizace RAGE zvyšuje aktivitu NFκB . Zvýšení transkripční aktivity NFκB může vést ke zvýšení exprese mRNA kolagenu typu I a1 a a2 v myších VSMC ošetřených AGEs, jak ukázali Peng et al . Souhrnně lze říci, že signalizace RAGE vyvolaná AGE ovlivňuje aktivitu NFκB ve VSMC, což může vést k remodelaci kolagenu typu I v ECM nebo ke změně morfologie buněk. Při jejich ošetření AGE-HSA se také snížily hladiny mRNA hladkého svalového těžkého křesla (SM-MHC) a SM-22α a navíc se snížila i exprese proteinů SM-α-aktinu, SM-22α a myokardinu (MyoC). Celkově vědci prokázali, že signalizace RAGE zasahuje do exprese markerů fenotypu hladkého svalstva v buňkách A7r5. Ztráta markerů fenotypu hladké svaloviny nabídla vysvětlení pro změny mechanických vlastností buněk hladké svaloviny při zvýšení signalizace AGE/RAGE. V buňkách A7r5 byla také pozorována zvýšená zrnitost, která prokazuje vizuální změnu morfologie buněk v důsledku zvýšené signalizace RAGE. Zatímco celková hustota aktinu se u buněk ošetřených AGE-HAS nezměnila, Youngův modul, měřítko pružnosti, odhalil, že základní tuhost buněk se výrazně zvýšila, což svědčí o tužším, méně pružném typu buněk. Byly také měřeny hladiny exprese proteinů fosforylovaného lehkého myozinového řetězce (MLC), aby bylo možné určit změny kontraktilní funkce a aktin-myozinem zprostředkované motorické aktivity. Tyto výsledky ukázaly, že při působení AGE-HSA na buňky A7r5 nedošlo k žádným změnám kontraktilní funkce. Souhrnně lze říci, že zvýšená signalizace AGE/RAGE mění mechanické vlastnosti VSMC, což má za následek tužší a méně poddajný typ buněk.
6. Závěr
Signalizace AGE/RAGE je komplexní a složitá kaskáda a byla studována u mnoha různých chorobných stavů. Zejména vaskulární kalcifikace zprostředkovaná diabetem vykazuje několik faktorů, které umožňují signalizaci AGE/RAGE silně ovlivňovat buněčné i systémové reakce. Bylo prokázáno, že vaskulární kalcifikace zvyšuje množství proteinů kostní matrix prostřednictvím signalizace PKC v podmínkách hyperglykémie a kalcifikace. AGEs indukovaná vaskulární kalcifikace způsobila downregulaci markerů VSMC a upregulaci proteinů kostní matrix, což naznačuje, že VSMC procházejí fenotypovým přepnutím na buňky podobné osteoblastům. Signalizace RAGE může rovněž zprostředkovat kalcifikaci VSMC prostřednictvím řady mitogenních drah. Z nich se ukázalo, že dráha p38 MAPK je nezbytnou součástí pro diferenciaci VSMC zprostředkovanou AGE/RAGE. Bylo také prokázáno, že fetuin A hraje při kalcifikaci cév kontroverznější roli. Fetuin A působí jako mediátor jak prokalcifikace umělou selekcí AGE jako ligand RAGE, tak i antikalcifikace v určitých modelech CDK. Fetuin-A představuje zajímavou oblast, na které je třeba dále pracovat, aby bylo možné pochopit jeho roli v cévní kalcifikaci jako diabetické komplikaci. Signalizace AGE/RAGE byla zapojena do oxidačního stresu spojeného s vaskulární kalcifikací zprostředkovanou diabetem prostřednictvím aktivace Nox-1, TGF-β zprostředkované fibrózy, NFκB a ERK1/2 cest a snížené exprese SOD-1. Výzkumníci zjistili, že farmakologické látky a některé antioxidanty snižují míru ukládání vápníku u AGEs indukované kalcifikace cév zprostředkované diabetem. Celkově byla role signalizace AGE/RAGE v cévní kalcifikaci zprostředkované diabetem přisuzována oxidačnímu stresu a fenotypovému přepnutí VSMC v podmínkách kalcifikace vyvolané AGEs, jak ukazuje obrázek 1. Budoucí směr v chápání vaskulární kalcifikace jako diabetické komplikace by mohl zahrnovat využití myší s knockoutem RAGE ke zkoumání účinků systémové inhibice RAGE na vaskulární kalcifikaci zprostředkovanou diabetem. Rovněž by mohla být lépe prozkoumána úloha fetuinu-A, aby bylo možné pochopit vzájemné působení tohoto biomarkeru a signalizace AGE/RAGE u diabetu II. typu.
Zveřejnění
Všechny názory, zjištění a závěry nebo doporučení vyjádřené v tomto materiálu jsou názory autorů a nemusí nutně odrážet stanoviska National Science Foundation.
Konkurenční zájmy
Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.
Příspěvek autorů
Všichni autoři se na tomto článku podíleli stejnou měrou.
Poděkování
Autoři by rádi poděkovali Dr. Donně M. Gordon za její podíl na vypracování a úpravě tohoto přehledu. Tato práce vznikla za podpory American Heart Association Beginning Grant-In-Aid no. 4150122 (JAS), American Heart Association Scientist Development Grant č. 5310006 (JAS) a Mississippi State University a její katedry biologických věd. Tento materiál rovněž vychází z práce podporované programem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program v rámci grantu č. 2015202674.
.