Abstract

Sygnalizacja AGE/RAGE jest dobrze zbadaną kaskadą w wielu różnych stanach chorobowych, szczególnie w cukrzycy. Ze względu na złożoną naturę receptora i wiele krzyżujących się szlaków, mechanizm sygnalizacji AGE/RAGE nadal nie jest dobrze poznany. Celem tego przeglądu jest zwrócenie uwagi na kluczowe obszary związane z mediowaną przez AGE/RAGE kalcyfikacją naczyń jako powikłaniem cukrzycy. Sygnalizacja AGE/RAGE w znacznym stopniu wpływa na komórkową i systemową odpowiedź na wzrost białek macierzy kostnej poprzez szlaki sygnałowe PKC, p38 MAPK, fetuin-A, TGF-β, NFκB i ERK1/2 zarówno w warunkach hiperglikemii, jak i zwapnienia. Wykazano, że sygnalizacja AGE/RAGE zwiększa stres oksydacyjny, promując zwapnienie naczyń w przebiegu cukrzycy poprzez aktywację Nox-1 i zmniejszenie ekspresji SOD-1. Sygnalizacja AGE/RAGE w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą była również przypisywana zwiększonemu stresowi oksydacyjnemu, co skutkowało fenotypową zmianą VSMC na komórki podobne do osteoblastów w zwapnieniu spowodowanym AGEs. Naukowcy odkryli, że środki farmakologiczne i niektóre antyoksydanty zmniejszają poziom odkładania się wapnia w zwapnieniach naczyń indukowanych AGEs w cukrzycy. Zrozumienie roli kaskady sygnalizacyjnej AGE/RAGE w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą pozwoli na farmakologiczną interwencję w celu zmniejszenia nasilenia tego powikłania cukrzycy.

1. Wprowadzenie

Cukrzyca to rodzina chorób charakteryzujących się podwyższonym poziomem glukozy we krwi lub hiperglikemią wynikającą z niezdolności organizmu do produkcji i/lub wykorzystania hormonu insuliny. Cukrzyca typu I jest związana z dysfunkcją komórek β trzustki, co prowadzi do utraty produkcji insuliny, natomiast cukrzyca typu II jest spowodowana dysfunkcją receptora insuliny, w której sygnalizacja receptora insuliny jest odłączona od wychwytu glukozy. Cukrzyca jest bardzo rozpowszechniona w Stanach Zjednoczonych, gdzie około 29 milionów ludzi żyje z cukrzycą lub 9,3% populacji. Stwierdzono, że wskaźnik zgonów z powodu chorób układu krążenia u osób w wieku 18 lat i starszych z cukrzycą był około 1,7 razy wyższy niż w normalnej populacji. Zwiększona śmiertelność z powodu cukrzycowej choroby sercowo-naczyniowej świadczy o ciężkości powikłań, które mogą wynikać z tej patologii. Dlatego związek między chorobą sercowo-naczyniową a cukrzycą jest niezbędny do zrozumienia.

2. Cukrzyca typu II a zwapnienie naczyń

Cukrzyca typu II została silnie powiązana ze zwapnieniem naczyń poprzez kilka różnych mechanizmów, z których niektóre obejmują stres oksydacyjny, hiperglikemię, hiperkaliemię i hiperkalcemię, przy czym stres oksydacyjny jest głównym przedmiotem tego przeglądu. Zwapnienie naczyń jest opisywane jako utwardzenie przyśrodkowej warstwy tętnicy poprzez odkładanie się minerałów hydroksyapatytu w macierzy zewnątrzkomórkowej. Proces ten, niegdyś uważany za pasywny i związany ze starzeniem się, obecnie okazał się być ściśle regulowanym przez komórki procesem. Podczas zwapnienia naczyń krwionośnych, białko morfogenetyczne kości-2 (BMP-2) aktywuje czynnik wiążący rdzeń alfa-1 (CBFA-1, znany również jako RunX2), który działa jako główny regulator transkrypcji dla dojrzewania osteoblastów w kości. CBFA-1 reguluje również produkcję białek osteoblastycznych w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), co jak się uważa, powoduje fenotypową zmianę VSMC na fenotyp osteoblastopodobny. Wykazano, że fosfataza alkaliczna (ALP) i sialoproteina kostna (BSP) są wczesnymi markerami aktywności osteoblastów, podczas gdy markery takie jak osteopontyna (OPN) i osteokalcyna ulegają podwyższeniu w późnym okresie procesu zwapnienia. Ich podstawową funkcją jest wzmocnienie tworzenia i odkładania hydroksyapatytu, który składa się z kolagenu typu I i innych białek niekolagenowych. Pierwotnie wskazany w tworzeniu kości, ALP jest odpowiedzialny za rozszczepianie pirofosforanu do fosforanu w celu promowania osadzania hydroksyapatytu i mineralizacji w kości . BSP jest odpowiedzialny za nukleację minerału hydroksyapatytu . Podobnie jak ALP, OPN jest również związany z odkładaniem hydroksyapatytu i może służyć jako mediator przywiązania komórek i sygnalizacji . Wielkość i kształt hydroksyapatytu są mediowane przez osteokalcynę poprzez mechanizm zależny od witaminy K. Łącznie, dane te pokazują potencjał promowania tworzenia kości w żywym systemie, a badacze wykorzystali tę wiedzę o białkach macierzy kostnej do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zwapnienia naczyń i cukrzycy typu II.

W serii badań przeprowadzonych przez Chen i wsp. tętnice pobrane od pacjentów z cukrzycą i bez cukrzycy były analizowane w celu określenia ilości wapnia, OPN, ALP, kolagenu typu I i BSP. Z wyjątkiem BSP, wszystkie badane białka macierzy kostnej były istotnie zwiększone w wyniku cukrzycy. Eksperymenty in vitro z użyciem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych bydła (BVSMCs) hodowanych w warunkach euglikemii (normalnej glukozy) i hiperglikemii wykazały, że poziomy CBFA1, ALP i osteokalcyny były znacząco wyższe w komórkach hodowanych w środowisku o wysokiej zawartości glukozy. Ponadto, odkładanie wapnia było również znacząco wyższe w podłożach o wysokiej zawartości glukozy niż w normalnej glukozie, a tendencja ta była również obserwowana, gdy oba rodzaje podłoży wzrostowych zostały uzupełnione o media zwapniające. Pożywki zwapniające zawierają podwyższony poziom nieorganicznego fosforanu, który promuje zwapnienie poprzez utylizację komórek, które muszą utrzymywać homeostazę. Aby określić mechanizmy sygnalizacyjne odpowiedzialne za zwiększoną ekspresję białek macierzy kostnej, BVSMCs poddano działaniu wysokiego poziomu glukozy, a aktywność kinazy białkowej C (PKC) została farmakologicznie zahamowana zarówno w komórkach normalnych, jak i poddanych działaniu wysokiego poziomu glukozy. PKC została wybrana jako ścieżka sygnalizacyjna ze względu na jej rolę w odpowiedzi komórkowej na cukrzycę i hiperglikemię. W rezultacie ekspresja białek macierzy kostnej była znacząco obniżona, podczas gdy w komórkach poddanych działaniu normalnej glukozy nie zaobserwowano znaczących zmian w ekspresji białek. W badaniu tym wykazano również zwiększone wydzielanie BMP-2 z BVSMC hodowanych w podłożu o wysokiej zawartości glukozy. Podsumowując, Chen i wsp. stwierdzili, że warunki hiperglikemiczne, obserwowane w cukrzycy, promują wzrost ekspresji białek macierzy kostnej i zwapnienie naczyń krwionośnych. Badania Mori i wsp. wykazały, że w VSMC szczurów chorych na cukrzycę OPN jest aktywowana i regulowana przez podobną ścieżkę opartą na PKC. Western blotting potwierdził, że inhibicja PKC spowodowała znaczący spadek ekspresji białka OPN. Łącznie, badania te wykazały nie tylko przewagę ekspresji białka macierzy kostnej w komórkach mięśni gładkich naczyń, ale również rolę PKC w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą.

3. Zwapnienie naczyń i sygnalizacja AGE-RAGE

Oprócz zwiększonej ekspresji białka macierzy kostnej w VSMC podczas leczenia cukrzycy i zwapnienia, badania wykazały również, że końcowe produkty zaawansowanej glikacji (AGEs) i ich receptory (RAGEs) odgrywają rolę w zwapnieniu naczyń. Wykazano, że pacjenci z cukrzycą typu II mają znacznie wyższe stężenie AGEs niż osoby bez cukrzycy. AGEs tworzą się przez całe życie w wyniku zwiększonej ilości krążącej glukozy, jak również innych cukrów redukujących, takich jak galaktoza i fruktoza, reagujących z grupami aminowymi białek w celu utworzenia zasad Schiffa, które albo podążają szlakiem poliolowym, dając AGEs, albo ulegają degradacji. Te glikowane produkty końcowe oddziałują z RAGEs, które są białkami transmembranowymi należącymi do nadrodziny immunoglobulin. RAGEs są wyregulowane w odpowiedzi na zwiększony poziom krążących AGE . Po związaniu AGE-RAGE, RAGE działa poprzez PKC-ζ w celu uruchomienia kaskady sygnałowej, która działa poprzez kinazę białkową aktywowaną mitogenem p38 (MAPK), transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) i czynnik jądrowy κB (NFκB). Suga i wsp. wykazali, że aktywacja sygnalizacji AGE-RAGE w szczurzych VSMC zmniejsza ekspresję markerów genowych VSMC, takich jak łańcuch ciężki mięśni gładkich – miozyna (SM-MHC) i mięsień gładki 22α (SM22α). To obniżenie ekspresji markerów VSMC sugeruje możliwość fenotypowego przełączenia VSMC na fenotyp osteoblastopodobny. Potwierdzają to wyniki uzyskane z ludzkich VSMC (HVSMCs), gdzie aktywacja RAGE zwiększała ekspresję mRNA i aktywność ALP, białka macierzy kostnej, sugerując rolę sygnalizacji RAGE w zwapnieniu naczyń. Badania te wykazały kilka podstawowych ról dla RAGE w zwapnieniu VSMC poprzez sygnalizację PKC-ζ, zwiększoną ekspresję ALP i zmniejszoną ekspresję markerów genowych VSMC.

W badaniach przeprowadzonych przez Tanikawa i wsp., przy użyciu modelu zwapnienia HVSMC in vitro, zwiększenie poziomu AGEs znacznie zwiększyło ilość odkładającego się wapnia po 7 i 14 dniach w porównaniu z próbkami traktowanymi BSA i kontrolnymi. Dodatkowo, ekspresja mRNA CBFA-1 (RunX2), aktywność ALP i poziom białka osteokalcyny były również znacząco podwyższone. Łącznie, dane te wskazują, że traktowanie AGE promuje fenotyp osteoblastopodobny w HVSMCs. Ta zmiana fenotypu nie była zależna od podłoża zwapniającego, ponieważ podobne wyniki uzyskano używając HVSMC hodowanych z i bez podłoża zwapniającego. Ekspresja białek osteoblastycznych w VSMC może być związana z aktywnością p38 MAPK, ponieważ Tanikawa i wsp. stwierdzili, że wraz ze wzrostem ekspozycji na AGE, aktywacja p38 MAPK była zwiększona. Odwrotnie, gdy sygnalizacja RAGE była tłumiona, aktywacja p38 MAPK była zmniejszona, a zmiany w p38 MAPK korelowały z obniżonym poziomem aktywności ALP pomimo zwapnienia wywołanego AGE. W podobnym badaniu przeprowadzonym przez Hu i wsp. wykazano, że p38 MAPK jest niezbędna do różnicowania osteoblastów w komórkach MC3T3-E1. Farmakologiczne zahamowanie p38 MAPK skutkowało zmniejszeniem aktywności ALP, dowodząc tym samym, że p38 MAPK jest wymagana do ekspresji ALP w komórkach osteoblastopodobnych. Aktywność ALP może być zatem bezpośrednio zależna zarówno od zwiększonej ekspozycji na AGE, jak i od zwiększonej sygnalizacji kaskady RAGE poprzez p38 MAPK. Ta zależność sugeruje, że p38 MAPK odgrywa kluczową rolę w ścieżce AGE-RAGE w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą .

Podczas gdy te wyniki pokazują znaczenie ścieżki AGE-RAGE w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą, Ren i wsp. wykazali, że AGEs również znacząco zwiększyły poziom wapnia wewnątrzkomórkowego w szczurzych VSMCs . Stwierdzono, że poziomy mRNA ALP i OPN były znacząco zwiększone po 24-godzinnej ekspozycji na glikowaną albuminę (AGE-BSA). Ze względu na wzrost ALP i OPN w wyniku traktowania AGE-BSA, grupa wykazała również, że RAGE został wyregulowany w szczurzych VSMC. Po inkubacji z przeciwciałem neutralizującym RAGE, ilość wapnia i ekspresja ALP ulegały zmniejszeniu. Zaobserwowane zmiany potwierdziły, że RAGE pośredniczy w indukowanym przez AGE zwapnieniu VSMC. Wei i wsp. wykazali, że cukrzyca przyspiesza zwapnienie aorty u samców szczurów rasy Wistar. Zwierzęta były leczone streptozocyną (STZ) w celu wywołania cukrzycy, a następnie poddawane działaniu witaminy D3 i nikotyny (VDN) w celu wywołania zwapnienia naczyń. Barwienie metodą von Kossa pozwoliło na wizualizację cząsteczek wapnia w usuniętej tkance aorty, a cząsteczki wapnia zostały znalezione w wybranym fragmencie tkanki. Analiza Western blot wykazała znaczący wzrost ekspresji ALP, a poziomy AGEs były również podwyższone u zwierząt z cukrzycą i leczonych VDN. Ważne jest, aby podkreślić, że podczas gdy sygnalizacja AGE-RAGE może bezpośrednio pośredniczyć w zwapnieniu naczyń w cukrzycy, sygnalizacja AGE-RAGE może również pośrednio wpływać na to powikłanie cukrzycowe.

4. Roles for Fetuin-A in Vascular Calcification and RAGE Signaling

Serum protein -Heremans-Schmid glycoprotein (Ahsg or fetuin-A), a systemically circulating glycoprotein, has been implicated in insulin resistance in type II diabetic patients . Dane pacjentów wykazały, że wysoki poziom fetuiny-A w surowicy był wskaźnikiem hiperglikemii w typie II. Fetuina-A utrudniała również odbiór insuliny poprzez hamowanie receptora insulinowego do autofosforylacji białka substratu receptora insulinowego-1, który jest kluczowy dla szlaku sygnałowego receptora insulinowego. Łącznie badania te wykazały, że fetuina-A odgrywa rolę w insulinooporności w cukrzycy typu II, co może prowadzić do dalszego nasilenia hiperglikemii i innych powikłań cukrzycowych. Co ciekawe, wykazano, że podwyższony poziom zwapnienia naczyń krwionośnych jest związany nie tylko z cukrzycą typu II, ale także z przewlekłą chorobą nerek (CKD). Wykazano, że w tym przypadku zwapnienie naczyń promuje zarówno reakcję zapalną, jak i stres oksydacyjny, co czyni je czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych. Fetuina-A jest uwolniona przez wątrobę by funkcjonować jak białko ostrej fazy we wrodzonym układzie odpornościowym , gdzie to funkcjonuje by promować przeciwzapalne i antyoksydacyjne odpowiedzi stresu by zahamować nadekspresję zapalnych molekuł.

Odwrotnie, fetuina-A może też wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną wywołaną częściowo przez toll-like receptory (TLRs). Mechanizm ten może być aktywowany przez wolne kwasy tłuszczowe (FFA) w celu wywołania odpowiedzi prozapalnej. Pal i wsp. wykazali, że fetuina-A może działać jako ligand dla TLR-4 w celu stymulowania insulinooporności indukowanej przez FFA w adipocytach. Oprócz promowania insulinooporności u pacjentów z cukrzycą typu II, fetuina-A może również hamować alternatywny ligand RAGE, high mobility group box-1 (HMGB1), który jest odpowiedzialny za uwalnianie i rekrutację kilku cytokin, cząsteczek adhezyjnych i chemokin. Wykazano, że aktywacja kaskady sygnałowej RAGE jest odpowiedzialna za pośredniczoną przez HMGB1 ekspresję czynnika martwicy nowotworów (TNF) i interleukiny-1 (IL-1). Zaniepokojenie budzi fakt, że hamowanie HMGB1 przez fetuinę-A mogłoby stworzyć warunki dla RAGE do preferencyjnego wyboru i wiązania AGEs w celu aktywacji kaskady. Wykorzystując dane zebrane z próbek pacjentów z CKD, Janda i wsp. wykazali, że zwiększony poziom fetuiny-A w surowicy był pozytywnym wskaźnikiem zwiększonego odkładania się AGEs w tętnicach, co wskazuje, że fetuina-A może pośrednio wpływać na szlak AGE/RAGE, szczególnie w obecności cząsteczek zapalnych.

Fetuina-A (Ahsg) ma wysokie powinowactwo do kryształów hydroksyapatytu, które znajdują się w miejscach zwapnienia naczyń, takich jak kości i zęby. Ketteler i wsp. wykorzystali pacjentów z CKD na hemodializie, aby skorelować śmiertelność sercowo-naczyniową z obniżonym poziomem fetuiny-A i zwiększonym zwapnieniem naczyń krwionośnych, sugerując, że fetuina-A działa jako inhibitor zwapnienia. Badania na modelu myszy z niedoborem fetuiny-A, które były wrażliwe na zwapnienie (DBA/2-Ahsg-/-) wykazały, że glikoproteina ta jest inhibitorem zwapnienia. Zdjęcia rentgenowskie kości i barwienie von Kossa płuc, serca, nerek i skóry ujawniły wizualny wzrost odkładania się fosforu i wapnia w każdym typie tkanki. Surowica krwi została pobrana od zwierząt DBA/2-Ahsg-/- w celu przeprowadzenia testu strącania zasadowego fosforanu wapnia (BCP) in vitro. Fetuina-A zmniejszyła ilość osadu BCP w surowicy, wskazując, że fetuina-A może hamować tworzenie się osadu BCP. W ramach tej samej grupy badawczej, Heiss i wsp. wykorzystali mikroskopię elektronową i dynamiczne rozpraszanie światła do określenia cech strukturalnych fetuiny-A kompleksującej z BCP w celu utworzenia cząstek kalcyproteiny. Dodatkowe badania z użyciem oczyszczonej fetuiny-A inkubowanej z BCP w warunkach in vitro wykazały zmianę struktury BCP ze sztywnej na kruchą. Ta obserwowana zmiana strukturalna była również obserwowana w innych materiałach opartych na wapniu, takich jak nanocząstki CaCO3 .

Zależność między fetuiną-A, BCP i zwapniałymi VSMCs została określona przy użyciu systemu modelowego in vitro i in vivo HVSMCs. Reynolds et al. zademonstrował , że fetuin-A był zlokalizowany w pęcherzykach macierzy zwapniałych HVSMCs w przyśrodkowej warstwie tętnicy. Te zwapniałe HVSMC poddano działaniu fetuiny-A, która hamowała odkładanie się wapnia i inkorporację wapnia w sposób zależny od dawki i z udziałem komórek. Wykazano, że VSMC ulegają zwapnieniu naczyniowemu pod wpływem pęcherzyków i ciał apoptotycznych. Mikroskopia i western blotting ujawniły, że apoptoza HVSMC była hamowana przez fetuinę-A. Zwapnienie uwolnionych pęcherzyków macierzy i ciałek apoptotycznych zostało określone ilościowo za pomocą analizy rentgenowskiej z dyspersją energii i wykazało, że fetuina-A hamuje również zwapnienie tych uwolnionych cząstek komórkowych. W tym samym badaniu wykazano, że fetuina-A jest inhibitorem zwapnienia HVSMC, w którym pośredniczą pęcherzyki macierzy i ciała apoptotyczne. W podobnych badaniach przeprowadzonych przez Moe i wsp. wykazano, że fetuina-A jest inhibitorem zwapnień w BVSMCs. Łącznie dane te dowodzą, że fetuina-A jest inhibitorem zwapnienia.

5. AGE-RAGE Signaling and Oxidative Stress in Vascular Calcification

Kaskada sygnalizacyjna AGE/RAGE została wykazana jako podobna do pętli sprzężenia zwrotnego, w której wyniki takie jak zwiększone włóknienie, zwiększona ekspresja RAGE i wzrost stresorów oksydacyjnych są produkowane. Stres oksydacyjny wytwarzany przez podwyższone reaktywne formy tlenu (ROS) może zaburzać liczne struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak błony komórkowe, białka, lipidy i DNA. Produkty ROS, takie jak nadtlenek wodoru, aniony ponadtlenkowe, rodniki hydroksylowe i tlenek azotu, są generowane przez mitochondrialne oksydazy, oksydazy NADPH (Nox) i syntazy tlenku azotu. Aktywacja RAGE powoduje zwiększoną produkcję ROS poprzez stymulację specyficznych kaskad sygnałowych, takich jak TGF-β, NF-κB i Nox-1. W badaniu przeprowadzonym przez Wei i wsp. stężenie dialdehydu malonowego (MDA) i aktywność dysmutazy ponadtlenkowej Cu/Zn (SOD-1) zostały wykorzystane do oceny stresu oksydacyjnego i zdolności do inicjowania kompensacyjnego mechanizmu stresu oksydacyjnego w modelach zwierzęcych zwapnienia naczyń spowodowanego cukrzycą. Zwierzęta z cukrzycą i zwapnieniem naczyń wywołanym przez VDN miały znaczący wzrost zawartości MDA i znaczący spadek poziomu aktywności SOD w porównaniu z grupą cukrzycową. Kiedy izolowane VSMC były traktowane wzrastającym poziomem AGE, obserwowano podwyższony poziom aktywności ALP, produkcję ROS z udziałem Nox-1 oraz ekspresję RAGE. Zahamowanie ekspresji RAGE w konsekwencji zmniejszyło aktywność ALP, zawartość wapnia i produkcję białka Nox-1, przy jednoczesnym zwiększeniu poziomu SOD-1. Ogólnie rzecz biorąc, badania te wykazały, że izolaty komórkowe z modelu cukrzycy z mediowanym przez VDN modelem zwapnienia naczyń krwionośnych były wrażliwe na działanie AGE, o czym świadczą znacznie zwiększone poziomy ALP, ROS, Nox-1 i białka RAGE w porównaniu do zwierząt wyłącznie cukrzycowych. Brodeur i wsp. wykorzystali podobny model zwierzęcy w celu ustalenia, czy AGEs w systemie in vivo mogą być zmniejszone po wystąpieniu zwapnienia naczyń spowodowanego cukrzycą. Pirydoksamina (PYR), inhibitor AGE, była podawana jako prewencyjne leczenie przed zwapnieniem, podczas gdy alagebrium (ALA), łamacz AGE, był podawany jako terapeutyczne leczenie po zwapnieniu. W tych badaniach, tylko ALA pozwolił na znaczącą redukcję liczby AGEs i zawartości wapnia mierzonych w tętnicach mięśniowych, takich jak tętnica udowa, ale nie w większych tętnicach przewodzących, takich jak aorta. PYR zmniejszył ogólny poziom AGE i wapnia, ale nie było to znaczące w badanych tkankach. Różnica w skuteczności obu terapii może wynikać z mechanizmów działania; PYR działa jako środek zapobiegający AGE, podczas gdy ALA działa jako środek rozbijający wiązania krzyżowe AGE. Zbadano również skuteczność kilku terapii antyoksydacyjnych, takich jak kwas alfa-liponowy, 4-hydroksy tempol i apocynina. Leczenie apocyną spowodowało znaczące zmniejszenie odkładania się wapnia w modelu zwierzęcym zwapnienia naczyń spowodowanego cukrzycą. Brodeur i wsp. wykazali, że redukcja wapnia poprzez ukierunkowaną terapię antyoksydacyjną ROS jest bardziej realnym sposobem leczenia w modelu in vivo zwapnienia naczyń krwionośnych. Łącznie, badania te pokazują, że kaskada AGE/RAGE jest zdolna do pośredniczenia w zwapnieniu naczyń poprzez mechanizmy stresu oksydacyjnego, a zabiegi terapeutyczne mające na celu ograniczenie produkcji ROS mogą stanowić bardziej realną alternatywę dla zminimalizowania zwapnienia naczyń.

Inną kaskadą sygnalizacji ROS aktywowaną przez AGEs jest transformujący czynnik wzrostu- (TGF-) β. W badaniu przeprowadzonym przez Li i wsp. kiedy VSMCs były traktowane AGEs, członkowie kaskady sygnalizacji AGE/RAGE (tj., p38 MAPK i ERK1/2) były fosforylowane po aktywacji RAGE. Ponadto, sygnalizacja TGF-β powodowała fosforylację mediatorów z jego rodziny, Smads, które służą jako modulatory transkrypcji. Stwierdzono, że zmiany te są zależne od TGF-β. Analiza Western blot wykazała, że gdy ekspresja RAGE była obniżona, fosforylacja Smad 2 była również zahamowana, wskazując na kaskadę AGE/RAGE w aktywacji Smad i sygnalizacji TGF-β. Ponieważ akumulacja AGEs odbywa się w obrębie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), należy zauważyć, że wzrost TGF-β jest związany z włóknieniem w obrębie choroby. Zwłóknienie jest zwykle związane ze wzrostem kolagenu typu I, a Li i wsp. wykorzystali analizę western blot, aby wykazać, że AGEs indukują zwiększoną produkcję kolagenu typu I, która została zahamowana przez blokadę sygnalizacji p38 MAPK i ERK1/2. Dane te pozwalają wnioskować, że sygnalizacja AGE/RAGE odgrywa rolę w utrzymaniu i regulacji ECM w cukrzycy oraz że AGE indukują TGF-β poprzez pośrednictwo RAGE .

Wykazano również, że AGE zwiększają aktywność NFκB poprzez sygnalizację RAGE w VSMCs. Badania wykazały, że VSMC utrzymują zgodny, kurczliwy fenotyp w tętnicy; jednak wzrost sygnalizacji NFκB zakłóca ten fenotyp, powodując zwiększoną sztywność i sztywność powszechnie związaną z sercowo-naczyniowymi powikłaniami cukrzycy. Simard i wsp. traktowali VSMC aorty szczurzej (komórki A7r5) glikowaną ludzką surowicą albuminową (AGE-HSA) i używając ekspresji GFP zaobserwowali znacząco zwiększoną aktywność NFκB. Analiza Western blot wykazała, że aktywacja ERK1/2 była znacząco zwiększona podczas leczenia AGE-HSA, a aktywacja AKT była nieznacznie zwiększona. Oba te szlaki aktywują NFκB, co pozwoliłoby wnioskować, że sygnalizacja RAGE zwiększa aktywność NFκB. Wzrost aktywności transkrypcyjnej NFκB może prowadzić do wzrostu ekspresji mRNA kolagenu typu I a1 i a2 w mysich VSMC poddanych działaniu AGEs, jak wykazano w Peng i wsp. Łącznie, sygnalizacja RAGE indukowana AGE wpływa na aktywność NFκB w VSMCs, co może prowadzić do remodelingu kolagenu typu I w ECM lub do zmiany morfologii komórek. Ponadto, gdy poddano je działaniu AGE-HSA, obniżono poziom mRNA ciężkiego kinazy mięśni gładkich (SM-MHC) i SM-22α, a także ekspresję białka SM-α-aktyny, SM-22α i miokardiny (MyoC). Ogólnie rzecz biorąc, badacze wykazali, że sygnalizacja RAGE zaburza ekspresję markerów fenotypu mięśni gładkich w komórkach A7r5. Utrata markerów fenotypu mięśni gładkich stanowiła wyjaśnienie zmian w mechanicznych właściwościach komórek mięśni gładkich w miarę wzrostu sygnalizacji AGE/RAGE. Zaobserwowano również zwiększoną ziarnistość w obrębie komórek A7r5, demonstrującą wizualną zmianę morfologii komórek spowodowaną zwiększoną sygnalizacją RAGE. Podczas gdy ogólna gęstość aktyny była niezmieniona w komórkach poddanych działaniu AGE-HAS, moduł Younga, miara elastyczności, ujawnił, że podstawowa sztywność komórek była znacząco zwiększona, wskazując na sztywniejszy, mniej elastyczny typ komórek. Poziomy ekspresji białka fosforylowanego łańcucha lekkiego miozyny (MLC) były również mierzone w celu określenia zmian w funkcji kurczliwej i aktywności motorycznej aktynowo-miozynowej. Wyniki te ujawniły, że nie wystąpiły żadne zmiany w funkcji kurczliwości, gdy komórki A7r5 były traktowane AGE-HSA. Podsumowując, zwiększona sygnalizacja AGE/RAGE zmienia właściwości mechaniczne VSMCs, skutkując sztywniejszym, mniej podatnym typem komórek.

6. Wnioski

Sygnalizacja AGE/RAGE jest złożoną i zawiłą kaskadą i była badana w wielu różnych stanach chorobowych. Zwłaszcza, cukrzycowa kalcyfikacja naczyń wykazuje kilka czynników, które pozwalają dla AGE/RAGE sygnalizacji by silnie wpłynąć zarówno komórkowe jak i systemowe odpowiedzi. Wykazano, że zwapnienie naczyń zwiększa ilość białek macierzy kostnej poprzez sygnalizację PKC w warunkach hiperglikemii i zwapnienia. Wywołane przez AGEs zwapnienie naczyń spowodowało obniżenie poziomu markerów VSMCs i podwyższenie poziomu białek macierzy kostnej, co sugeruje, że VSMCs ulegają fenotypowej przemianie w komórki podobne do osteoblastów. Sygnalizacja RAGE może również pośredniczyć w zwapnieniu VSMC poprzez szereg szlaków mitogennych. Spośród nich wykazano, że szlak p38 MAPK jest niezbędnym elementem różnicowania VSMC pod wpływem AGE/RAGE. Wykazano również, że fetuina A odgrywa bardziej kontrowersyjną rolę w zwapnieniu naczyń krwionośnych. Fetuina A działa jako mediator zarówno prokalcyfikacji poprzez sztuczną selekcję do AGEs jako ligand RAGE, jak i antykalcyfikacji w pewnych modelach CDK. Fetuina A stanowi ekscytujący obszar, w którym należy wykonać więcej pracy, aby zrozumieć jej rolę w zwapnieniu naczyń jako powikłaniu cukrzycy. Sygnalizacja AGE/RAGE została włączona do stresu oksydacyjnego związanego ze zwapnieniem naczyń spowodowanym cukrzycą poprzez aktywację Nox-1, TGF-β, NFκB i ERK1/2 oraz zmniejszoną ekspresję SOD-1. Badacze odkryli, że środki farmakologiczne i niektóre antyoksydanty zmniejszają poziom odkładania się wapnia w indukowanym przez AGEs zwapnieniu naczyń krwionośnych w cukrzycy. Ogólnie rzecz biorąc, rola sygnalizacji AGE/RAGE w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą została przypisana stresowi oksydacyjnemu i fenotypowej zmianie VSMC w warunkach zwapnienia spowodowanego AGE, jak pokazano na rycinie 1. Przyszły kierunek rozumienia zwapnienia naczyń jako powikłania cukrzycy może obejmować wykorzystanie myszy pozbawionych RAGE w celu zbadania wpływu ogólnoustrojowej inhibicji RAGE na zwapnienie naczyń spowodowane cukrzycą. Można również lepiej zbadać rolę fetuiny-A, aby zrozumieć wzajemne oddziaływanie tego biomarkera i sygnalizacji AGE/RAGE w cukrzycy typu II.

Rycina 1

Schemat sygnalizacji AGE/RAGE w zwapnieniu naczyń spowodowanym cukrzycą.

Ujawnienie

Wszelkie opinie, ustalenia i wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Konkurencyjne interesy

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów.

Wkład autorów

Wszyscy autorzy w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Donnie M. Gordon za jej wkład w rozwój i redakcję tego przeglądu. Praca ta jest wspierana przez American Heart Association Beginning Grant-In-Aid no. 4150122 (JAS), American Heart Association Scientist Development Grant nr 5310006 (JAS) oraz Mississippi State University i jego Wydział Nauk Biologicznych. Ponadto, materiał ten powstał na podstawie pracy wspieranej przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant no. 2015202674.

.