Aristoteles unterrichtete Alexander (356-323 v. Chr.), bevor der Prinz 336 v. Chr. den Thron von Makedonien erbte und begann, das Reich, das sein Vater durch Eroberung gewonnen hatte, zu vergrößern. Später wurde der Garten des Lyzeums in Athen mit Pflanzen bepflanzt, die von Anhängern von Alexanders Armeen beigesteuert wurden. Theophrastus stützte viele seiner Pflanzenbeschreibungen auf Berichte, die er von Reisenden erhalten hatte, die ferne Regionen von Alexanders Reich besucht hatten. Die Bibliothek in Alexandria, die Dioskurides wahrscheinlich benutzte, wurde während der Herrschaft von Alexanders General Ptolemaios I. Soter (ca. 367 v. Chr.-ca. 283 v. Chr.) eröffnet. Ptolemaios I. war ein enger persönlicher Freund Alexanders und war möglicherweise ein Mitschüler von Aristoteles. Er wurde 323 v. Chr. nach Alexanders Tod Herrscher von Ägypten. Die eigentliche Arbeit der Planung und Überwachung der Bibliothek wurde Demetrius von Phaleron (ca. 350-ca. 280 v.u.Z.), einem Schüler von Theophrastus am Lyzeum, übertragen.

Alexander regierte Makedonien ab 340 v.u.Z. als Regent, während sein Vater Philipp II. eine große makedonische Armee anführte, die in Thrakien einfiel, dem Land, das im Osten an Makedonien grenzte. Später geriet Alexander mit Philipp in Streit und verließ Makedonien. 336 v. Chr. wurde Philipp ermordet und der 20-jährige Alexander wurde Alexander III. von Makedonien, der später Alexander der Große genannt wurde. Als sich die Nachricht von Philipps Tod verbreitete, sahen die Menschen in den von den Makedoniern eroberten Ländern die Chance, ihre Freiheit zu ergreifen, und Alexander musste handeln. Er begann damit, alle seine Gegner innerhalb Makedons hinzurichten, und stellte dann die makedonische Herrschaft in Griechenland, Thrakien und Illyrien wieder her.

Nachdem er den erfahrenen Feldherrn Antipater (ca. 398-319 v. Chr.) mit der Aufgabe betraut hatte, die Ordnung im eigenen Land aufrechtzuerhalten, führte Alexander 334 v. Chr. als erste Etappe seiner imperialen Expansion eine große Streitmacht nach Kleinasien. Die Makedonen besiegten ein großes persisches Heer, sicherten die kleinasiatische Küste und bekämpften und besiegten 333 v. Chr. ein weiteres persisches Heer, diesmal unter der Führung des persischen Königs Dareios III. Alexanders Streitkräfte kämpften sich dann durch Syrien und Phönizien nach Süden vor. Im Frühjahr 331 v. Chr. drangen die Makedonier in Ägypten ein. Nach einigen Monaten kehrten sie nach Tyrus zurück, wo sie Verstärkung aus Europa erhielten und nach Osten zogen. Sie besiegten die Perser ein weiteres Mal bei Gaugemala östlich des Tigris, besetzten Babylon und eroberten anschließend Susa und die persische Hauptstadt Persepolis. Die Makedonen nahmen daraufhin die Verfolgung von Dareios wieder auf, den sie aufgrund von Wunden, die ihm einer seiner eigenen Adligen zugefügt hatte, sterbend vorfanden – dieser wurde später von den Makedonen gefangen genommen und auf Alexanders Befehl hin bestraft. Sie drangen nach Osten in Zentralasien vor und erreichten das Tian-Shan-Gebirge in Westchina, wo in einer Grabstätte die Statuette eines griechischen Soldaten gefunden wurde.

Im Jahr 326 v. Chr. lud Alexander die Häuptlinge aus dem heutigen Nordpakistan ein, sich seiner Herrschaft zu unterwerfen. Einige stimmten zu, aber andere widersetzten sich den Makedoniern und wurden erst nach heftigen Kämpfen, bei denen Alexander verwundet wurde, überwunden. Die makedonischen Soldaten, die sich nach ihrer Heimat und ihren Familien sehnten, widersetzten sich Alexanders Plan, weiter nach Indien vorzudringen, und überzeugten ihn, umzukehren. Sie erreichten Babylon, wo Alexander am 11. Juni 323 v. Chr. im Palast von Nebukadrezzar II. starb. Die Historiker sind sich über die Ursache seines Todes nicht sicher, aber es ist sehr wahrscheinlich, dass er an einer Krankheit starb. In einem weiteren Monat wäre Alexander 33 Jahre alt geworden. Wie die folgende Karte zeigt, erstreckte sich sein Reich in seiner Blütezeit von Makedonien im Westen bis zum Indus-Tal im Osten und von den südlichen Ufern des Schwarzen und Kaspischen Meeres bis nach Ägypten. Schon wenige Jahre nach Alexanders Tod begann das Reich zu zerfallen und zerfiel in viele unabhängige Königreiche.

Alexander war ein Schüler von Aristoteles gewesen, und obwohl die Ausbildung des jungen Mannes unterbrochen wurde, war er hochintelligent, und Aristoteles hatte einen starken Einfluss auf seine Entwicklung ausgeübt. Aristoteles ermutigte alle seine Schüler, die natürliche Welt zu beobachten und zu erforschen, und Alexander interessierte sich sehr für Pflanzen und Tiere. Ein großes Gefolge von Gelehrten begleitete ihn, als er seine Armeen anführte. Sie maßen Entfernungen, fertigten Karten an, studierten unbekannte Religionen und auch die Flora und Fauna. Wenn sie auf unbekannte Pflanzen- oder Tierarten stießen, schickte Alexander Exemplare nach Europa zurück, viele davon an das Lyzeum in Athen, um sie Aristoteles persönlich vorzustellen. Er sammelte so viele Informationen wie möglich über lokale pflanzliche Behandlungen und praktizierte Medizin, indem er einige der Verletzungen und Krankheiten seiner Soldaten persönlich behandelte.

Im Jahr 332 v. Chr. gründete Alexander die Stadt Alexandria an der Stelle von Rhakotis, einem ägyptischen Fischereihafen. Er beabsichtigte, mit der Stadt eine Brücke zwischen den Kulturen Griechenlands und Ägyptens zu schlagen, aber er blieb nur wenige Monate nach Baubeginn dort und kehrte nie zurück. Nach Alexanders Tod gelang es Ptolemaios I., seinen Leichnam in die Stadt überführen zu lassen. Die Bibliothek in Alexandria wurde als Nachbildung des Lyzeums gebaut, mit einem Säulengang und Gärten. Es gab Hörsäle, Lesesäle und einen gemeinsamen Speisesaal. Die Bibliothek befand sich neben dem Musaeum, einem Tempel, der als akademische Einrichtung genutzt wurde, und stand in dessen Dienst – daher stammt auch das Wort Museum. Die Leiter der Bibliothek hatten den Auftrag, alle Informationen der Welt zu sammeln. Vertreter der Bibliothek nahmen an Buchmessen in Athen und Rhodos teil, und wenn ein Schiff in den Hafen einlief, wurden alle Bücher, die es an Bord hatte, beschlagnahmt und kopiert, wobei die Bibliothek die Originale behielt und die Kopien an den Kapitän zurückgab. Dies ist die Bibliothek, in der Pedanius Dioskurides studiert haben könnte. Ein Großteil der Bibliothek wurde 48 v. Chr. während eines Bürgerkriegs versehentlich niedergebrannt, und obwohl eine Zweigstelle der Bibliothek, die so genannte Tochterbibliothek, im Süden der Stadt weiter funktionierte, wurde auch sie 391 n. Chr. zerstört, als der römische Kaiser Theodosius I. (347-395) die Zerstörung aller heidnischen Tempel anordnete.