I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Enzymatische Reaktion (Bild wird in einem neuen Fenster geöffnet)

Chymotrypsin ist eine Serin-Endopeptidase, die von den Azinuszellen des Pankreas produziert wird. Chymotrypsin wird nach der Proteolyse von Chymotrypsinogen durch Trypsin aktiviert. Während Trypsin an Lysin und Arginin hydrolysiert, spaltet Chymotrypsin selektiv Peptidbindungen, die von aromatischen Resten (Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan) gebildet werden (Hedstrom et al. 1992). Zwei vorherrschende Formen von Chymotrypsin, A und B, kommen in gleicher Menge in der Bauchspeicheldrüse von Rindern vor. Es handelt sich um sehr ähnliche Proteine (80 % identisch), die sich jedoch in ihren proteolytischen Eigenschaften deutlich unterscheiden (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 und Gráf et al. 2004). Die folgenden Informationen beziehen sich hauptsächlich auf die A-Form von Chymotrypsinogen und Chymotrypsin.

Geschichte:

In den frühen 1900er Jahren schlug Vernon vor, dass Pankreaspräparate einen intrinsischen Aktivator seiner eigenen Enzyme hervorbringen könnten (Vernon 1901). In seinen Experimenten zur Milchgerinnung stellte Vernon fest, dass mindestens zwei Enzyme vorhanden waren und dass eines stabiler war als das andere (Vernon 1902). Diese Idee wurde jedoch erst 1934 allgemein akzeptiert, als Kunitz und Northrop das Vorhandensein eines weiteren Enzyms neben Trypsin bestätigten und es Chymotrypsin nannten. Es gelang ihnen, Chymotrypsin sowie die inaktive Vorstufe, das Chymotrypsinogen, zu kristallisieren (Kunitz und Northrop 1934). Im Jahr 1938 isolierte Kunitz verschiedene aktive Formen von Chymotrypsin und bezeichnete sie als Alpha, Beta und Gamma (Kunitz 1938).

In den frühen 1940er Jahren untersuchten Fruton und Bergmann die Spezifität von Chymotrypsin weiter und berichteten über mehrere neue Substrate (Fruton und Bergmann 1942). Jacobsen identifizierte bald weitere Formen von Chymotrypsin und bezeichnete sie als delta und pi (Jacobsen 1947). Im Jahr 1948 charakterisierte Schwert die Molekulargewichte von Chymotrypsin und Chymotrypsinogen. 1954 wurde der erste Beweis für den dreistufigen Mechanismus der Hydrolyse von Amid- und Estersubstraten durch Chymotrypsin von Hartley und Kilby erbracht, die das Vorhandensein eines Acyl-Enzym-Zwischenprodukts vermuteten, was sich später als richtig herausstellte (Henderson 1970). 1955 gewann Laskowski ein zweites kristallines Chymotrypsinogen und nannte es Chymotrypsinogen B. 1964 bestimmte Hartley die Aminosäuresequenz von Chymotrypsin A, die später von Meloun et al. 1966 verfeinert wurde. Im Jahr 1968 bestimmten Smillie et al. die Aminosäuresequenz von Chymotrypsin B, die 80 % Sequenzidentität mit Chymotrypsin A aufwies. In den 1970er und 1980er Jahren wurden Forschungsarbeiten durchgeführt, um den Wirkungsmechanismus besser zu verstehen und die Unterschiede in den Aminosäuresequenzen von Trypsin und Chymotrypsin zu identifizieren (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth und Polgár 1983 und Gráf et al. 1988).

In den 1990er Jahren wurde Chymotrypsin aus anderen Quellen gereinigt, darunter Kabeljau (Ásgeirsson und Bjarnason 1991) und Kamel (Al-Ajlan und Bailey 1997). Es wurde auch mit der Untersuchung von Inhibitoren begonnen (Baek et al. 1990), und Frigerio et al. klärten die Kristallstruktur von Rinderchymotrypsin mit einer Auflösung von 2,0 Å auf (Frigerio et al. 1992).

Neuere Forschungen untersuchten die Faltung und Denaturierung von Chymotrypsin über eine Reihe von Konzentrationen (Ghaouar et al. 2010), die Wechselwirkung von Chymotrypsin mit Nanopartikelsubstraten (You et al. 2006 und Jordan et al. 2009) und die Erhöhung der Stabilität von Chymotrypsin durch Konjugation mit PEG-Molekülen (Castellanos et al. 2005 und Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Spezifität:

Chymotrypsin wird durch die Spaltung der Bindung zwischen Arginin und Isoleucin (R15 und I16) durch Trypsin aktiviert, was zu strukturellen Veränderungen und zur Bildung der Substratbindungsstelle führt (Sears 2010). Chymotrypsin unterscheidet sich von Trypsin dadurch, dass Trypsin Peptide an Arginin- und Lysinresten spaltet, während Chymotrypsin große hydrophobe Reste bevorzugt (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsin katalysiert bevorzugt die Hydrolyse von Peptidbindungen, an denen L-Isomere von Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan beteiligt sind. Es wirkt auch leicht auf Amide und Ester empfindlicher Aminosäuren ein. Die Spezifität von Chymotrypsin für große hydrophobe Reste lässt sich durch ein hydrophobes S1-Bindungspockett erklären, das durch die Reste 189 bis 195, 214 bis 220 und 225 bis 228 gebildet wird (Cohen et al. 1981).

Obwohl die Struktur der S1-Stelle von Trypsin und Chymotrypsin nur einen einzigen Unterschied aufweist (an Position 189), konnten durch ortsgerichtete Mutagenese von Trypsin und Chymotrypsin keine Spezifitäten ausgetauscht werden, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus, durch den Trypsin und Chymotrypsin die substratspezifische Katalyse erreichen, nicht vollständig verstanden ist (Steitz et al. 1969 und Gráf et al. 1988).

Molekulare Merkmale:

Chymotrypsin A und B haben eine 80%ige Sequenzidentität (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 und Gráf et al. 2004). Die Aminosäuren der katalytischen Triade (H57, D102 und S195) sind in den Sequenzen der Peptidasen der Familie S1 hoch konserviert (Gráf et al. 2004). Das Serin an Position 214 ist ebenfalls in der Familie hoch konserviert und wurde als viertes Mitglied der katalytischen Triade vorgeschlagen (Ohara et al. 1989 und McGrath et al. 1992).

Zusammensetzung:

Die drei Aminosäurereste der katalytischen Triade (H57, D102 und S195) sind essentiell für die Spaltung von Peptidbindungen und werden durch Wasserstoffbrücken stabilisiert (Sears 2010 und Gráf et al. 2004). G193 und S195 bilden das Oxyanionloch und interagieren mit der Carbonylgruppe der spaltbaren Peptidbindung und orientieren sie, um das tetraedrische Zwischenprodukt zu bilden (Rühlmann et al. 1973, Huber und Bode 1978 und Gráf et al. 2004).

Protein-Hinterlegungsnummer: P00766

CATH-Klassifikation (v. 3.3.0):

• Klasse: Hauptsächlich Beta
• Architektur: Beta-Trommel
• Topologie: Trypsin-ähnliche Serinprotease

Molekulargewicht:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Optimaler pH-Wert: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Isoelektrischer Punkt:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, theoretisch)
• 8.33 (Chymotrypsin, theoretisch)

Extinktionskoeffizient:

• 51.840 cm-1 M-1 (theoretisch)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretisch)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretisch)

Aktivstellenreste:

• Histidin (H57)
• Aspartat (D102)
• Serin (S195)

Aktivatoren:

• Cetyltributylammoniumbromid (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammoniumbromid (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammoniumbromid (Spreti et al. 2001)

Inhibitoren:

• Hydroxymethylpyrrole (Abell und Nabbs 2001)
• Borsäuren (Smoum et al. 2003)
• Courmarinderivate (Pochet et al. 2000)
• Peptidylaldehyde (Lesner et al. 2009)
• Peptide aus natürlichen Quellen (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, und Chopin et al. 2000)
• Peptide, die eine unnatürliche Aminosäure enthalten (Legowska et al. 2009, und Wysocka et al. 2008)

Anwendungen:

• Sequenzanalyse
• Peptidsynthese
• Peptidkartierung
• Peptid-Fingerprinting