Zellkultur, Virusamplifikation und -reinigung für SHAPE-MaP- und SPLASH-Experimente

Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) und Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen wurden in Minimum Essential Medium (Merck) gezüchtet, das mit 2 mM l-Glutamin und 10% FCS ergänzt wurde. WSN (H1N1)-Virenstämme wurden durch Infektion von MDBK-Zellen mit Influenzaviren bei einer Infektionsmultiplikation (MOI) von 0,01 hergestellt. Virenstämme von Udorn (H3N2)- und PR8 (H1N1)-Viren wurden durch Infektion von MDCK-Zellen bei einer MOI von 0,001 in Gegenwart von 0,8 μg ml-1 n-Tosyl-l-phenylalaninchlormethylketon (TPCK)-behandeltem Trypsin (Merck) hergestellt. Die Viren wurden 2 Tage nach der Infektion gesammelt. Die Viren wurden durch Ultrazentrifugation gereinigt: Zunächst wurde das infizierte Zellkulturmedium durch Zentrifugation bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei 4 °C geklärt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten bei 4 °C. Anschließend wurde das Virus durch Zentrifugation durch ein 30%iges Saccharosekissen bei 25.000 Umdrehungen pro Minute für 90 Minuten bei 4 °C in einem SW 32 Rotor (Beckman Coulter) gereinigt. Das gereinigte Viruspellet wurde in einem Resuspensionspuffer (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA) resuspendiert. Wir weisen darauf hin, dass weder die Tertiärstrukturen der Virionen noch die der RNA durch die Ultrazentrifugation gestört werden30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP wurde gemäß den veröffentlichten Prokotolen17 durchgeführt; 1-Methyl-7-nitroisatosäureanhydrid (1M7) wurde aus 4-Nitroisatosäureanhydrid synthetisiert, wie zuvor beschrieben33. Für die Experimente mit in vitro transkribierter RNA wurde jedes virale RNA-Segment aus einer linearen DNA-Vorlage mit dem HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs) synthetisiert. Die Produkte wurden auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE)-Harnstoff-Gel auf Größe und Reinheit geprüft. Nackte virale RNA-Proben wurden durch Aufreinigung der WSN-Partikel über ein Saccharosekissen wie oben beschrieben hergestellt. Gereinigte Viren wurden mit 250 μg ml-1 Proteinase K (Roche) in Proteinase-K-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) für 40 Minuten bei 37 °C behandelt. Vor der Modifikation wurden in vitro transkribierte RNA und nackte virale RNA-Proben bei 37 °C für 30 min in Faltungspuffer (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) gefaltet. 1M7 (gelöst in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO; Merck)) wurde der gefalteten RNA in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, und die Proben wurden für 75 s bei 37 °C inkubiert. Die in-virio-Modifikationen wurden durch Zugabe von 1M7 direkt zum gereinigten Virus durchgeführt. Die Fähigkeit der SHAPE-MaP-Reagenzien, in virale Partikel einzudringen, wurde zunächst wie zuvor beschrieben34 getestet, indem 32P-markierte Primer-Verlängerungen an RNA durchgeführt wurden, die aus mit SHAPE-MaP-Reagenzien behandelten Viren extrahiert worden war, wobei ein NA-Segment-Zielprimer (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′) verwendet wurde. Parallel zu den mit 1M7 behandelten Proben wurden Kontrollproben mit DMSO behandelt. Das SHAPE-MaP-Reagenz n-Methylisatosäureanhydrid (NMIA; Thermo Fisher Scientific) wurde ebenfalls in virio getestet. Die Experimente mit NMIA wurden wie für 1M7 beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die gereinigten Virionen 45 Minuten lang mit NMIA behandelt wurden.

Die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek wurde wie zuvor beschrieben17 gemäß dem Randomer-Workflow durchgeführt. Kurz gesagt, nach der 1M7- oder Kontrollbehandlung wurde die RNA mit dem RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gereinigt. Die RNA wurde mit dem Random Primer Mix (New England Biolabs) mit SuperScript II (Invitrogen) in MaP-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM Dithiothreitol und 0,5 mM Desoxynukleosidtriphosphat) reverse-transkribiert. Das Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) wurde zur Vorbereitung der DNA-Bibliotheken verwendet. Die endgültigen PCR-Amplifikationsprodukte wurden mit Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) größenselektiert und mit dem Agilent DNA 1000 Kit (Agilent Technologies) auf einem Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies) auf ihre Qualität hin überprüft. Für WSN, nackte virale RNA und in vitro transkribierte RNA wurden die Bibliotheken auf einem HiSeq 4000 System (Illumina) sequenziert (2 × 150 Basenpaare (bp)); für PR8 und Udorn-Viren wurden die Bibliotheken auf einem NextSeq 500 System (Illumina) sequenziert (1 × 150 bp).

SPLASH

SPLASH-Proben wurden wie zuvor veröffentlicht24,35, mit einigen Änderungen, für jeweils zwei Replikate von WSN-, PR8- und Udorn-Viren und ein einzelnes Replikat für jedes der H3N2-Reassortanten-Viren hergestellt. Gereinigtes Virus wurde mit 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) und 0,01 % Digitonin (Merck) für 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das Virus wurde auf einer 6-Well-Schale verteilt, mit einer Glasplatte abgedeckt, auf Eis gelegt und 45 Minuten lang mit einer UVP Ultra Violet Product Handheld UV-Lampe (Thermo Fisher Scientific) bestrahlt. Das vernetzte Virus wurde mit Proteinase K behandelt, und die virale RNA wurde mit TRIzol (Invitrogen) extrahiert. Ein Aliquot der extrahierten viralen RNA wurde zum Nachweis des Biotin-Einbaus mit einem Chemilumineszenz-Nukleinsäure-Detektionsmodul-Kit (Thermo Fisher Scientific) auf einer Hybond-N-Nylonmembran (GE Healthcare Life Sciences) verwendet. Der Rest der extrahierten viralen RNA wurde mit dem NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) fragmentiert und mit dem RNA Clean & Concentrator-5 Kit auf Fragmente mit einer Länge von weniger als 200 nt selektiert. Die Proben wurden mit Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads (Thermo Fisher Scientific) auf biotinylierte virale RNA angereichert; On-Bead Proximity Ligation und Psoralen-Cross-Link Reversal wurden wie zuvor veröffentlicht durchgeführt24,35. Die Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem kommerziellen SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories) hergestellt. Die endgültige Größenauswahl erfolgte, indem die PCR-amplifizierten Sequenzierungsbibliotheken auf einem 6%igen PAGE-Gel (Thermo Fisher Scientific) in Tris/Borsäure/EDTA (TBE) laufen gelassen wurden, wobei auf 200-300 bp DNA selektiert wurde. Die Bibliotheken wurden mit 1 × 150 bp auf einem NextSeq 500 System sequenziert.

Bearbeitung von SHAPE-MaP-Sequenzierungs-Reads

Die Sequenzierungs-Reads wurden mit Skewer v0.2.2 (Ref. 36) auf die Entfernung von Adaptoren getrimmt. Die SHAPE-MaP-Reaktivitätsprofile wurden mit der veröffentlichten ShapeMapper2-Pipeline37 erstellt, die die Reads am Referenzgenom ausrichtet und die Mutationsraten an jeder Nukleotidposition berechnet. Die Mutationsraten werden dann in die SHAPE-MaP-Reaktivitätswerte umgerechnet, die wie folgt definiert sind:

wobei mutr1M7 die Nukleotidmutationsrate in der 1M7-behandelten Probe und mutrDMSO die Mutationsrate in der DMSO-behandelten Probe ist. Alle SHAPE-MaP-Reaktivitäten wurden auf eine ungefähre 0-2-Skala normalisiert, indem die SHAPE-MaP-Reaktivitätswerte durch die durchschnittliche Reaktivität der 10 % höchst reaktiven Nukleotide nach Ausschluss von Ausreißern (definiert als Nukleotide mit Reaktivitätswerten, die >1,5 des Interquartilsbereichs sind) geteilt wurden. Hohe SHAPE-MaP-Reaktivitäten weisen auf flexiblere (d. h. einzelsträngige) RNA-Regionen hin, niedrige SHAPE-MaP-Reaktivitäten auf strukturell eingeschränktere (d. h. basengepaarte) RNA-Regionen.

Verarbeitung von SPLASH-Sequenzierungs-Reads

Die Sequenzierungs-Reads wurden mit Skewer v0.2.2 (Ref. 36) auf die Entfernung von Adaptoren getrimmt. STAR v.2.5.3 (ref. 38) wurde verwendet, um die Reads an das entsprechende Virus-Referenzgenom zu alignieren (siehe Tabelle 2). Nur die chimären Reads, bei denen mindestens 20 nt an den Referenzsegmenten ausgerichtet waren, wurden für die weitere Verarbeitung verwendet (STAR-Parameter: -chimSegmentMin 20). Chimäre Reads wurden anhand von CIGAR-Strings und Alignment-Positionen dedupliziert. Die CIGAR-Strings in jedem Read-Alignment wurden verarbeitet, um die Start- und Endkoordinaten der Reads zu ermitteln. Die Koordinaten der chimären Reads wurden verwendet, um eine Matrix der Sequenzinteraktionen in der R-Software zu erstellen. Diskrete Loci in der Matrix wurden ausgewählt und einzeln mit einer Gauß-Kurve auf der Grundlage der Leseüberlappungsintensität angepasst, um ein Interaktionsfenster zu definieren; Interaktionsfenster komplexer überlappender Loci wurden in einzelne Fenster unterteilt. Die Breite des Interaktionsfensters wurde verwendet, um die Start- und Endkoordinaten jeder Interaktion zu bestimmen; die Anzahl der Reads, die innerhalb (oder teilweise innerhalb) dieser Region lagen, wurde als Maß für die Interaktionshäufigkeit verwendet. Für die Erstellung von Abbildungen wurden die 20 wichtigsten Interaktionen in jedem Virus mit dem circlize-Paket v.0.4.5 (ref. 39) in R v.3.5.1 visualisiert. Der vollständige Satz von Interaktionsloci ist in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt. Für die qPCR-Validierung der interagierenden Loci wurden die mit Psoralen vernetzten Proben wie zuvor beschrieben vorbereitet und angereichert, jedoch mit einer verkürzten Fragmentierungszeit (3 gegenüber 4 Minuten), um längere RNA-Fragmente zu erzeugen. Die RNA wurde mit Poly(A)-Polymerase (Takara Bio) polyadenyliert, und komplementäre DNA wurde mit dem smRNA dT Primer (Takara Bio) und PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Eine qPCR mit 50 Zyklen wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einem StepOnePlus-Instrument (Applied Biosystems) unter Verwendung des Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix mit ROX (Agilent Technologies) und Primerpaaren durchgeführt, um auf Intersegment-Interaktionen zu testen. Die Primer-Sequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 3 aufgeführt. Nach 50 Zyklen der qPCR-Amplifikation wurden die Produkte durch 8%ige PAGE (29:1 Acrylamid/Bis-Acrylamid, 1× TBE-Puffer) aufgelöst und mit Blaulichttransillumination visualisiert.

RNA-Strukturvorhersagen

Der IntaRNA-Algorithmus v.2.3.1 (Ref. 40) wurde verwendet, um die Fähigkeit von RNA-RNA-Interaktionen in den Regionen vorherzusagen, die während der SPLASH-Analyse identifiziert wurden, unter Verwendung der Optionen Exact mode (-mode E) und no seed constraint (-noSeed). SHAPE-MaP-Reaktivitäten wurden in die Modellierung von RNA-RNA-Wechselwirkungen einbezogen (-tShape und -qShape). Permutierte Datensätze wurden durch zufälliges Mischen der von SPLASH identifizierten spezifischen Interaktionspartner und Bewertung der Interaktions-ΔG-Energien mit IntaRNA erzeugt. Die Signifikanz des Unterschieds zwischen den Wahrscheinlichkeitsverteilungen der ΔG-Energien, die mit den von SPLASH identifizierten intermolekularen RNA-Interaktionen im Vergleich zu den permutierten Datensätzen verbunden sind, wurde mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests in der R-Software berechnet. Die IntaRNA-Strukturvorhersagen wurden dann verwendet, um die Interaktionsregionen auf die an der Basenpaarung beteiligten Nukleotide zu trimmen. In Fällen, in denen keine SHAPE-MaP-Daten verfügbar waren (PR8-Reassortanten mit H3N2-Viren), wurde die Vorfaltung der einzelnen RNA-Stränge („Zugänglichkeit“) in IntaRNA deaktiviert (-qAcc = N -tAcc = N). Zur Validierung anhand bekannter Strukturen wurden RNA-Sekundärstrukturdaten aus der RNA3Dhub-Datenbank41 extrahiert, die auf den kryogenen elektronenmikroskopischen Strukturen des 80S-Ribosoms42 (PDB: 6EK0) und des U4/U6.U5-Triple Small Nuclear Ribonucleoprotein Spliceosomal Complex43 (EMDB: EMD-2966) basieren. Die Referenz-RNA-Sequenzen wurden so korrigiert, dass sie mit den bovinen (MDBK) Sequenzen für ribosomale RNA und kleine nukleare U4/U6-RNAs übereinstimmen, wie zuvor beschrieben44. Für intramolekulare RNA-Strukturvorhersagen wurde das ViennaRNA-Paket v.2.0 (Ref. 45) verwendet. Der Befehl RNAfold wurde verwendet, um sekundäre RNA-Strukturen und Partitionsfunktionen für jedes Segment vorherzusagen. SHAPE-MaP-Reaktivitäten wurden als Pseudoenergie-Beschränkungen einbezogen. Eine 50 nt gleitende Medianfenster-Korrelationsanalyse zwischen den ex virio und in virio SHAPE-MaP-Reaktivitätsprofilen wurde verwendet, um das Ausmaß der SHAPE-MaP-Korrelation zwischen T7-transkribierter und vRNP-assoziierter RNA zu bestimmen. Wir fanden heraus, dass es keine Korrelation >150 nt gab; daher setzten wir die maximale Paarungsdistanzbeschränkung für Struktur- und Partitionsfunktionsvorhersagen auf 150 nt. Für intramolekulare Strukturvorhersagen haben wir die Nukleotide innerhalb der Promotorregion als einzelsträngig festgelegt.

Zellkultur für das Reverse-Engineering von Influenzaviren

MDCK-Zellen und humane embryonale Nierenzellen (HEK 293T) wurden aus einer bestehenden Sammlung in der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Universität Melbourne entnommen. MDCK-Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (Sigma-Aldrich) und HEK 293T-Zellen in DMEM (Thermo Fisher Scientific) gezüchtet. Beide Medien wurden mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM l-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 24 μg ml-1 Gentamicin, 50 μg ml-1 Streptomycin und 50 IU ml-1 Penicillin ergänzt. Kokulturen von MDCK-Zellen und HEK 293T-Zellen für die Transfektion wurden in Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) mit 50 μg ml-1 Streptomycin und 50 IU ml-1 Penicillin angelegt.

Konstruktion von Reverse-Engineering-Influenzaviren

Einzelne Gensegmente der Viren PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) und Wyo03 (H3N2) wurden revers transkribiert und in pHW2000-Plasmide kloniert46. Die aus der reversen Genetik abgeleiteten Viren enthielten entweder ein PR8-, Udorn-, Mem71-, PC73- oder Wyo03-PB1-Gen mit einem Wildtyp- oder modifizierten NA-Gen in einem genetischen Hintergrund, der sechs Segmente des PR8-Virus (PB2, PA, HA, NP, M und NS) umfasst. Das modifizierte NA-Gen (Wyo03UdSub) wurde von Wyo03 abgeleitet und trug vier Substitutionen in der Udorn-NA-Sequenz: die Nukleotide G943A, C938U, U933C und G923A. Drei dieser vier Nukleotidänderungen waren stumm, während die vierte (A534G) zu einer konservativen Lysin-zu-Arginin-Veränderung (K172R) führte. Komplementäre Fragmente, die diese Änderungen enthalten, wurden durch PCR erzeugt und durch eine weitere PCR-Runde mit segment-spezifischen Primern, die BsmBI-Restriktionsstellen47 enthalten, zusammengefügt; das Produkt wurde in den pHW2000-Expressionsvektor zur Virusrettung kloniert. Die Primer-Sequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 3 angegeben. Die geretteten Viren wurden in 10-d-embryonierten Hühnereiern amplifiziert. Die infektiöse Allantoisflüssigkeit wurde durch Plaquebildung in MDCK-Zellen48 auf ihren Virusgehalt hin titriert und bei -80 °C gelagert.

Bestimmung der viralen Replikationskinetik von Reverse-Engineering-Viren

Die Replikationscharakteristika der Reverse-Engineering-Viren wurden durch Infektion von MDCK-Zellen mit einer MOI von 0,01 bestimmt. Nach 1 h Absorption (bei t = 0 h) wurde das Inokulum entfernt und die Zellen wurden gewaschen und bei 37 °C, 5 % CO2 in RPMI 1640, ergänzt mit 2 mM l-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 24 μg ml-1 Gentamicin, 50 μg ml-1 Streptomycin, 50 IU ml-1 Penicillin und 1 μg ml-1 TPCK-behandeltem Trypsin (Worthington Biochemical Corporation), inkubiert. Die Zellkulturüberstände wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion entnommen und zur Analyse bei -80 °C gelagert. Die Virustiter wurden durch Plaquebildung auf konfluenten Monolayern von MDCK-Zellen bestimmt.

Kompetitives Reverse-Engineering von Influenzaviren mit neun Plasmiden

Das kompetitive Reverse-Engineering von Influenzaviren wurde mit einer modifizierten Version des Reverse-Genetik-Systems mit acht Plasmiden26 durchgeführt, wie zuvor beschrieben25. Plasmide, die für die viralen RNA-Segmente PB2, PB1, PA, Hämagglutinin (HA), Nukleoprotein (NP), Matrixprotein (M) und Nicht-Strukturprotein (NS) von PR8 kodieren, wurden mit Plasmiden kotransfiziert, die für virale Neuraminidase (NA)-RNA und konkurrierende virale PB1-RNA von entweder Udorn, Mem71, PC73 oder Wildtyp oder modifiziertem Wyo03 kodieren. Jedes Plasmid (1 µg) wurde mit FuGENE 6 Transfektionsreagenz (Promega) in Opti-MEM gemischt und zu einer Kokultur aus HEK 293T- und MDCK-Zellen gegeben. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch Opti-MEM ersetzt, das mit 50 μg ml-1 Streptomycin und 50 IU ml-1 Penicillin ergänzt war. Vierundzwanzig Stunden später wurde TPCK-behandeltes Trypsin (1 μg ml-1) zugegeben und der Überstand nach weiteren 42 Stunden gesammelt und bei -80 °C gelagert. Um die Inkorporationshäufigkeiten der konkurrierenden PB1-Gene zu bestimmen, wurden die Nachkommenviren im Transfektionsüberstand einem Plaque-Assay in MDCK-Zellen unterzogen. Zufällig ausgewählte Plaques (ca. 36 pro Experiment) wurden durch Probenahme durch die Agarose hindurch entnommen und in 0,05 % Triton-X100 resuspendiert. Die Quelle der konkurrierenden Gensegmente wurde durch genspezifische quantitative RT-PCR unter Verwendung des SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR Kits (Bioline) identifiziert. Jede 20 μl-Reaktion wurde unter Verwendung von 5 μl plaque-gepickter Virussuspension, 10 μl 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step-Mix, 0,2 μl Reverse Transkriptase, 0,4 μl Ribosafe RNase-Inhibitor, 0,8 μl jedes 10 μM gen-spezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimers und 0,08 μl jeder 25 μM gen-spezifischen Sonde durchgeführt. Die Primer- und Sondensequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 3 aufgeführt. Die RT-PCR-Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 45 °C inkubiert, bevor mit der qPCR-Amplifikation gemäß den Anweisungen des Herstellers fortgefahren wurde. Bei den angegebenen Werten handelt es sich um kombinierte Daten aus 3-8 unabhängigen Transfektionsexperimenten für jeden Wettbewerb.

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.