Abstract
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine detaillierte Beschreibung der Ultrastruktur der sekretorischen Zellen der Pankreasinseln des südamerikanischen Welses Rhamdia quelen vorliegt. Es wird der Nachweis erbracht, dass die α-Granula aus einem zentralen und einem äußeren Teil mit unterschiedlicher Elektronendichte und Löslichkeit bestehen, dass es sich bei den δ-Zellen höchstwahrscheinlich um morphologisch veränderte, aber lebensfähige α-Zellen handelt und dass die β-Granula möglicherweise eine sich wiederholende Substruktur besitzen und daher eine intrazelluläre kristalline Speicherform des Insulins darstellen können.
1. Einleitung
Die Langerhans-Inseln wurden 1869 von Langerhans beim Kaninchen entdeckt. Sie wurden jedoch von Stannius und Blockmann etwa 20 Jahre früher bei Teleostierchen entdeckt und werden daher auch, wenn auch weniger häufig, als Stannius- oder Blockmann-Körperchen bezeichnet. Die Langerhans-Inseln sind endodermalen Ursprungs und finden sich bei den meisten Teleosteern als kleine Körperchen, die im exokrinen Teil des Pankreas verstreut sind.
Der Fisch hat kein eigenständiges Pankreas. Exokrines Pankreasgewebe findet sich verstreut im Darmtrakt. Die azinäre Struktur des exokrinen Pankreas ist der von Säugetieren sehr ähnlich und besteht aus Zellen mit einem sehr dunklen, basophilen Zytoplasma . Bei Fischen, die sich aktiv ernähren, enthalten sie eine große Anzahl heller, eosinophiler, sekretorischer Granula. Die endokrinen Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse konnten unterschieden werden, und das Gewebe umfasst α-Zellen (die glucagonähnliche Peptide produzieren), β-Zellen (die Insulin produzieren) und d-Zellen (die Somatostatin produzieren). Bei Säugetieren und Menschen waren die meisten früheren elektronenmikroskopischen Beschreibungen erwachsener menschlicher Pankreasinseln nur kurz, und ein kleiner Teil der Veröffentlichungen ist in erster Linie Beschreibungen von β-Zelltumoren oder Übersichtsartikeln gewidmet, in denen die vergleichende Morphologie der Inseln verschiedener Spezies erörtert wird.
Die Bauchspeicheldrüse von Fischen erweist sich nicht oft als geeignete Gewebequelle für elektronenmikroskopische Untersuchungen. Die Hauptbauchspeicheldrüse von Fischen ist sowohl anatomisch als auch entwicklungsgeschichtlich der Bauchspeicheldrüse von Säugetieren ähnlich, während bei anderen Fischarten große Unterschiede zu beobachten sind. Beim erwachsenen Zebrafisch enthält das Hauptpankreas mehrere Hauptinseln, die von exokrinem Gewebe umgeben sind. Ein Schwanz aus einzelnen Inseln, die in exokrinem Gewebe und Fett eingebettet sind, erstreckt sich nach kaudal entlang des Darms. Im Gegensatz dazu befinden sich die β-Zellen des Tilapia (ein weiterer glukoseempfindlicher Teleost) in Langerhans-Inseln, die sich entlang des Mesenteriums befinden und nicht von exokrinem Gewebe umgeben sind. Rhamdia quelen ist ein Teleost und eine wichtige Art für die Aquakultur in subtropischen Klimazonen. R. quelen kommen von Südmexiko bis Zentralargentinien vor, und die Zucht dieser Art breitet sich nach Südbrasilien aus.
In der vorliegenden Studie analysieren wir die Ultrastruktur der Langerhans-Inseln und beschreiben detailliert die verschiedenen Arten von sekretorischen Zellen im südamerikanischen Wels R. quelen.
2. Materialien und Methoden
Vier gezüchtete R. quelem – zwei Weibchen und zwei Männchen (g; cm) – aus dem Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) in der nordöstlichen Region Argentiniens wurden in 200-Liter-Behältern gehalten, wo sie vor der Nekropsie zwei Wochen lang akklimatisiert wurden. Die Fische wurden mit gefiltertem Süßwasser aufgezogen, das bei 25°C mit einer Wasserwechselrate von 100 % pro Tag gehalten wurde. Die Photoperiode wurde auf 12 Stunden Dunkelheit und 12 Stunden Licht eingestellt. Sie wurden viermal täglich von Hand mit handelsüblichem Futter (Ganave) gefüttert. Die Fische wurden mit Benzocain (500 ppm) euthanasiert und seziert. Proben des Fettgewebes, das sich kaudal entlang des Darms erstreckt, wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt.
Kleine Gewebefragmente wurden in 1 mm große Blöcke geschnitten und sofort in phosphatgepuffertem Glutaraldehyd (pH 6.9 bei 4°C) fixiert, in Millonigscher Lösung gewaschen und in 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert; die Gewebeblöcke wurden dann in einer abgestuften Reihe von Ethanol-Aceton dehydriert, in Propylenoxid getaucht und in Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Schweiz) eingebettet. Dünnschnitte wurden mit einem LKB-Ultramikrotom geschnitten und vor der Untersuchung in einem Jeol JEM-8T-Elektronenmikroskop (Jeol, Tokio, Japan) doppelt mit Uranylacetat und Bleizitrat gefärbt.
3. Ergebnisse
3.1. Lichtmikroskopie
Bei R. quelen ist die Bauchspeicheldrüse im Fettgewebe verstreut, das den Hauptgallengang umgibt; sie liegt in einer etwa dreieckigen Region, die oben vom Magen, vorne von der Leber und unten von der Milz und der Gallenblase begrenzt wird. Jede Langerhans-Insel besteht aus relativ reinem Inselgewebe, das von exokrinem Pankreas umgeben ist (Abbildung 1). Es wurden keine Unterschiede zwischen Männern und Frauen festgestellt.
3.2. Elektronenmikroskopie
Die β-Zellen, die normalerweise das Innere der Inseln besetzen, waren häufig, aber nicht immer, durch die peripher gelegenen α-Zellen vom exokrinen Pankreas getrennt (Abbildung 2). Das ultrastrukturelle Erscheinungsbild der β-Zellen war bei den Proben der vier Fische identisch. Die charakteristischen β-Granula befanden sich in glattmembranigen Säcken und waren in Größe und Form variabel. Es waren rechteckige, quadratische, sechseckige und unregelmäßig polygonale Kristalle sichtbar. Runde Formen waren vorhanden, aber weniger häufig (Abbildungen 2 bis 5). Jedes Granulat bestand aus einer oder mehreren kristallinen oder unstrukturierten Formen unterschiedlicher Größe und Form. Die Wahl des Fixiermittels schien die innere Struktur der β-Granula nicht zu beeinflussen. Innerhalb der Grenzen der umhüllenden Membran erschien der Bereich an der Peripherie der Kristalle leer oder enthielt einen feinen flockigen Niederschlag, unabhängig vom verwendeten Fixiermittel. Bei höheren Vergrößerungen war manchmal eine sich wiederholende Substruktur in den Kristallen sichtbar, die in Bezug auf die Schnittebene richtig orientiert waren (Abbildungen 6 und 7). Die zahlreichen Mitochondrien waren über die gesamte Zelle verteilt und erschienen als runde oder plumpe fadenförmige Strukturen. Sie waren größer und zahlreicher als die der β-Zelle, aber meist kleiner als die der Pankreas-Azinuszellen. Die zahlreichen mitochondrialen Cristae waren größtenteils transversal ausgerichtet, und mitochondriale Granula waren vorhanden, aber nicht auffällig. Die Zisternen des granulären endoplasmatischen Retikulums waren in der Regel kurz oder bläschenförmig (Abbildungen 2 bis 4). Das granuläre endoplasmatische Retikulum und die freien Ribosomen waren in den β-Zellen nicht so deutlich ausgeprägt wie in den Azinus- oder β-Zellen. Die β-Zellen mit wenigen sekretorischen Granula waren normalerweise reicher mit Ribosomen und granulärem endoplasmatischem Retikulum ausgestattet, das dann häufiger zisternenförmig war (Abbildung 5).
Der Golgi-Komplex war nach der Aldehyd-Fixierung stärker ausgeprägt und die einzelnen Strukturen waren stärker erweitert (Abbildung 2). Nach Verwendung dieser Fixierungsmittel war gelegentlich dichtes amorphes Material innerhalb der Golgi-Vesikel sichtbar, das unreife Granula oder Vorläufer der β-sekretorischen Granula darstellen kann. Die β-Zellkerne waren in der Regel kugelförmig und hatten eine relativ glatte Kontur. Die Zellmembran benachbarter Inselzellen lag eng an den Desmosomen an, obwohl sie nicht häufig durch diese verbunden waren. An der Verbindungsstelle von drei oder mehr Zellen waren die Grenzmembranen oft gefaltet, mit gewundenen Verflechtungen zwischen den Zellen (Abbildungen 2 und 9). Multivesikuläre zytoplasmatische Einschlüsse, die Ceroid ähneln, waren in den meisten β-Zellen auffällig (Abbildungen 2, 7, 9 und 8). Das Auftreten und die Häufigkeit dieser Einschlüsse wurden durch die primäre Verwendung von Osmiumsäure oder Aldehyd als Fixiermittel nicht nennenswert beeinflusst, und es gab keinen offensichtlichen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein dieser Körnchen und dem morphologischen Nachweis einer physiologischen Aktivität der Zellen. Die Ultrastruktur der α-Zellen war in allen vier Gewebeproben gleich. Größe und Form dieser Zellen und ihrer Zellkerne unterschieden sich nicht wesentlich von denen normaler β-Zellen (Abbildungen 2 und 7). Obwohl man gelegentlich eine α-Zelle mit einem unregelmäßig geformten oder eingedrückten Kern fand, kam dies nicht häufig genug vor, um als nützliches Unterscheidungskriterium zu dienen. Die zytoplasmatischen Granula der α-Zellen blieben durch primäre Osmium-Fixierung als dichte, kugelförmige Körper von unterschiedlicher Größe erhalten und waren in locker sitzenden, glattmembranigen Säcken enthalten (Abbildungen 7 und 9). Sie waren größer als die β-Granula, aber wesentlich kleiner als die Zymogengranula der Azinuszellen (Abbildung 2). Die schlanken, länglichen Mitochondrien waren mäßig zahlreich und kleiner als die der β-Zellen und besaßen Cristae, die in der Regel transversal ausgerichtet waren. Das granuläre endoplasmatische Retikulum war oft zisternenförmig angeordnet und reichlicher vorhanden als in den β-Zellen (Abbildung 9). Der Golgi-Komplex war, wenn er sichtbar war, von mäßigem Ausmaß. Dichte amorphe Materialien innerhalb der Golgi-Bläschen und -Zisternen, vermutlich die Vorläufer der sekretorischen Granula, waren in α-Zellen häufiger als in β-Zellen (Abbildung 10). Ceroidkörper waren zwar häufig sichtbar, aber weniger zahlreich als in den β-Zellen (Abbildungen 2 und 3). Die Säcke, in denen sich die α-Granula befinden, schienen also vollständig gefüllt zu sein, und man kam zu dem Schluss, dass die Granula aus einem abgerundeten, inneren, dichten Kern und einem äußeren, weniger elektronendichten Mantel bestehen, der nach der Osmium-Fixierung fehlte (Abbildungen 3 und 9) und daher vielleicht besser löslich war. Weder in den inneren noch in den peripheren Teilen der α-Granula war eine einheitliche Substruktur erkennbar. Zu keinem Zeitpunkt wurden Zellen gesehen, die als Übergangsformen zwischen α-Zellen und β-Zellen interpretiert werden könnten. Die α-Granula, einschließlich der äußeren und inneren, dichteren Teile, waren in ihrer Gesamtgröße mit den „δ-Granula“ vergleichbar. Außerdem sind Zwischenzellen vorhanden, die Granula beider Typen enthalten, was darauf hindeutet, dass die δ-Zellen tatsächlich modifizierte α-Zellen sind (Abbildung 10). Die δ-Zellen wurden sichtbar gemacht, obwohl sie sich fast immer zwischen den α-Zellen befanden, und wurden aufgrund der geringeren Elektronendichte und der größeren Gesamtgröße ihrer sekretorischen Granula identifiziert und ultrastrukturell von den α-Zellen unterschieden. Außerdem sind Zwischenzellen vorhanden, die Granula beider Typen enthalten, was darauf hindeutet, dass die δ-Zellen tatsächlich modifizierte α-Zellen sind (Abbildung 11).
Obwohl ein umgekehrtes Verhältnis zwischen der Anzahl der sekretorischen Granula und der Prominenz des Golgi-Komplexes und des granulären endoplasmatischen Retikulums bestand, wurde kein Muster der Freisetzung von α- oder β-Granula beobachtet. Eine dünne Basalmembran und unterschiedliche Mengen an Bindegewebe trennten die Pankreasinseln normalerweise von den benachbarten Azinuszellen (Abbildung 2). Gelegentlich war jedoch keine Basalmembran zwischen Insel- und Azinuszellen vorhanden, die dann nur durch den schmalen interstitiellen Raum getrennt waren. Die gefensterten Kapillarendothelzellen waren immer mindestens durch die Kapillarbasalmembran von ihnen getrennt (Abbildung 9). Andere stützende Elemente, einschließlich Kollagen und elastische Gewebebestandteile, waren manchmal ebenfalls vorhanden. Es wurden keine Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen festgestellt.
4. Diskussion
Die β-Zellen der Fische lassen sich anhand der Morphologie der sekretorischen Granula leicht von den α-Zellen unterscheiden. Das häufige Vorhandensein von eckigen Untereinheiten und die offensichtliche sich wiederholende Substruktur lassen auf eine kristalline Natur der β-Granula schließen. Versuche, die Dimensionen eines Kristallgitters aufzulösen und zu messen, sind bisher nicht erfolgreich gewesen. Wenn sekretorische Granula in der Nähe des Golgi-Komplexes sichtbar gemacht wurden, wurden in der Regel keine kristallinen Untereinheiten beobachtet. Daher liegt die Vermutung nahe, dass die nichtkristallinen Granula oder das amorphe Material innerhalb des Golgi-Komplexes eine andere chemische oder physikalische Form von Insulin oder des Insulinproteinkomplexes darstellen als die kristallinen Untereinheiten der Granula. Es ist nicht bekannt, ob diese verschiedenen morphologischen Formen innerhalb der β-Granula unterschiedliche Löslichkeiten und vielleicht unterschiedliche Muster oder Freisetzungsraten als Reaktion auf physiologische Anforderungen haben. Sekretorische Granula wurden nicht in den Zisternen oder Vesikeln des granulären endoplasmatischen Retikulums beobachtet. Es wird angenommen, dass der Golgi-Komplex, wie bei anderen Protein-sekretierenden Zellen, die Funktion hat, das im granulären endoplasmatischen Retikulum synthetisierte Produkt zu konzentrieren oder zu „verpacken“. Daraus würde logischerweise folgen, dass die glatten Membransäcke, in denen die sekretorischen Granula enthalten sind, von Golgi-Membranen und nicht vom granulären endoplasmatischen Retikulum stammen.
Die α-Zellen mit ihren großen, runden, dichten sekretorischen Granula sind den α-Zellen anderer Spezies recht ähnlich. Obwohl die Granula der α-Zellen in ihrer Größe stark variieren, scheinen die meisten Zellen ein Sortiment unterschiedlich großer Granula zu besitzen, was eine Unterklassifizierung dieses Zelltyps, wie sie für andere Arten vorgeschlagen wurde, ausschließt. Bisher wurden keine physiologischen Daten veröffentlicht, die die Existenz der „δ-Zelle“ in der Pankreasinsel der Fische belegen. Die verschiedenen Protagonisten haben die Existenz der δ-Zellen mit Daten untermauert, die auf lichtmikroskopischen Untersuchungen von kapriziösem Silber, Phosphorwolframsäure-Hämatoxylin und anderen Körnchenfärbungen oder elektronenmikroskopischen Untersuchungen von schlecht erhaltenen Geweben beruhen. Die hier vorgestellten mikroskopischen Aufnahmen stützen die von Bloom 1931 und später von Gomori 1941 vertretene Ansicht, dass δ-Zellen modifizierte α-Zellen darstellen könnten.
Der Übergang vom typischen α-Granulum mit inneren dichten und äußeren weniger dichten Abschnitten zu einem δ-Granulum von etwa gleicher Größe mit einheitlicher, aber verringerter Dichte geht häufig mit einem allmählichen Verlust der morphologischen Integrität oder der Färbeintensität der Mitochondrien, des Golgi-Komplexes und der membranösen Komponenten des granulären endoplasmatischen Retikulums einher. Die intakten und lebensfähig erscheinenden Zellkerne sowie die geringe Anzahl freier Ribosomen und Ceroidkörperchen deuten darauf hin, dass die so genannten δ-Zellen auch im vermuteten Endstadium dieses Übergangs lebensfähig sind, d. h. wenn die sekretorischen Granula selbst nicht mehr sichtbar sind und alle zytoplasmatischen Organellen außer Ceroidkörnern und Ribosomen fehlen. In Ermangelung physiologischer Daten, die den δ-Zellen eine Funktion zuweisen, und in Ermangelung zwingenderer morphologischer Beweise für einen separaten Zelltyp hofft man, dass die hier dargelegte Darstellung eines wahrscheinlichen Übergangs von α-Zellen zu δ-Zellen als die wahrscheinlichste Erklärung für die dritte granuläre Zelle von Bloom beim Menschen akzeptiert wird. Die Bedeutung dieser lebensfähigen, aber veränderten α-Zellen ist nicht bekannt. Obwohl α- und β-Zellen einzeln oder in kleinen Clustern in den Azini und Gängen vorkommen können, wurden in keiner der vier untersuchten Pankreasproben Zwischenformen zwischen Azinus- und Inselzellen bzw. Gang- und Inselzellen gesehen, wie von Nakamura und Yokote (4) vorgeschlagen worden war.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.
Dankbarkeit
L. A. Romano erhielt Produktivitätsforschungsstipendien vom brasilianischen Forschungsrat CNPq (Prozess Nr. PQ 301002/2012-6).