Ergebnisse und Diskussion
Zwei Wege zur Pt-Oxidation in E. coli. Genetische Studien haben gezeigt, dass das Enzym C-P-Lyase, das durch das phn-Operon kodiert wird, Pt oxidieren kann (26). In einer kürzlich durchgeführten Studie (9) stellten wir jedoch überrascht fest, dass einige E. coli phn-Mutanten weiterhin in der Lage waren, Pt zu oxidieren. Die Untersuchung des Genotyps dieser Stämme legte nahe, dass der phoA-Locus an der Pt-Oxidation beteiligt sein könnte. Um diese Hypothese direkt zu testen, untersuchten wir E. coli-Stämme, die sich nur in den phn- und phoA-Loci unterschieden, auf ihre Fähigkeit, Pt zu oxidieren, was sich in ihrer Fähigkeit zeigte, auf Medien mit Pt als einziger P-Quelle zu wachsen. Da Phosphat für das Wachstum erforderlich ist, können die Organismen auf diesem Medium nur wachsen, wenn sie die Fähigkeit haben, Pt zu Phosphat zu oxidieren. Stämme, die entweder phoA + oder phn + waren, wuchsen auf Pt-Medium (unabhängig davon, ob der andere Locus mutiert war), während Stämme mit Mutationen sowohl in phn als auch in phoA dies nicht taten (Abb. 1). Daher verfügt E. coli über zwei Wege für die Oxidation von Pt: einen, der von phn abhängt, und einen, der von phoA abhängt.
Zur Unterstützung dieser Hypothese haben wir die Pt-abhängige H2-Produktion sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen. Die In-vitro-Untersuchungen wurden aerob in versiegelten Gefäßen unter Verwendung von hochgereinigtem BAP durchgeführt. Nach der Inkubation wurde der Kopfraum auf H2 und der wässrige Teil auf Phosphat untersucht. Wie in Abb. 2B gezeigt, wurden aus Pt in Gegenwart von BAP stöchiometrische Mengen an Phosphat und H2 gebildet, während in Kontrollreaktionen, die entweder BAP oder Pt allein enthielten, weder Phosphat noch H2 gebildet wurden.
Die Produkte der BAP-katalysierten Pt-Oxidation sind Phosphat und molekulares H2.(A) Die protonenentkoppelten 31P-Kernresonanzspektren und Peakpositionen sind für 5 mM Pt und 5 mM Phosphat-Kontrollen sowie für eine Übernachtreaktion, die anfänglich 5 mM Pt plus 500 μg gereinigtes BAP enthielt, angegeben. Im Spektrum der enzymatischen Reaktion sind ein Peak für nicht umgesetztes Pt und ein neuer Phosphatpeak zu erkennen, aber es wurden keine weiteren Produkte gebildet. Die leichte Verschiebung der Position des Phosphat-Peaks zwischen der Kontrolle und dem BAP-katalysierten Reaktionsprodukt ist auf geringfügige pH-Unterschiede zurückzuführen: Die Zugabe von Phosphat-Stammlösung zum Assay erhöhte die Höhe des Pi-Peaks, führte aber nicht zu zusätzlichen Peaks. Die Protonen-gekoppelten Spektren stimmen mit dieser Interpretation völlig überein (Daten nicht gezeigt). (B) Die BAP-katalysierte Pt-Oxidation erzeugt stöchiometrische Mengen an Phosphat und molekularem H2. In vitro-Reaktionen, die die angegebenen Komponenten enthielten, wurden über Nacht bei 37 °C in versiegelten Gefäßen inkubiert. Die Headspace-Atmosphäre wurde dann mittels Gaschromatographie mit Wärmeleitfähigkeitsdetektion auf H2 untersucht, während die wässrige Phase mit Hilfe des Malachitgrün-Tests auf Phosphat untersucht wurde. Die Reaktionen (3 ml) wurden in 50 mM Mops (pH 7,0) mit 50 mM Pt (pH 7,0) und 387 μg gereinigtem BAP, wie angegeben, durchgeführt. Es wurden dreifache Kontrollen durchgeführt, die entweder BAP oder Pt allein enthielten, aber weder Phosphat noch H2 wurden unter diesen Bedingungen nachgewiesen. Die In-vivo-Ergebnisse zeigen die H2-Menge, die während des Wachstums von WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) in 0,4 % Glucose/Mops-Bouillon mit 2,5 μmol der angegebenen P-Quelle produziert wurde. Da diese P-Menge (500 μM) wachstumslimitierend ist, wird erwartet, dass die P-Quelle vollständig assimiliert wird, wenn die Kulturen die Sättigung erreichen. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37 °C in versiegelten Gefäßen wurde der Kopfraum durch Gaschromatographie mit Wärmeleitfähigkeitsdetektion auf H2 untersucht. Sowohl die in vitro- als auch die in vivo-Experimente wurden aerob durchgeführt (d. h. O2 war während der Pt-Oxidation vorhanden).
Die Messung von H2 in vivo wird durch die Tatsache erschwert, dass E. coli mehrere Hydrogenasen besitzt, die sowohl H2 produzieren als auch verbrauchen können. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir eine ΔhypABCDE-Mutante konstruiert, die keine aktiven Hydrogenasen produzieren kann, weil sie nicht in der Lage ist, die Vorläuferproteine zu reifen (32). Die hyp-Mutante, die aerob in versiegelten Röhren kultiviert wurde, produzierte auch ungefähr stöchiometrische Mengen an H2 in Kulturen, die mit wachstumslimitierenden Mengen an Pt kultiviert wurden, während in Kulturen, die mit limitierenden Mengen an Phosphat oder dem Phosphatester Phosphoserin kultiviert wurden, kein H2 nachgewiesen wurde (Abb. 2B ).
Pt-Oxidation ist kein gemeinsames Merkmal aller alkalischen Phosphatasen. Eine effiziente Pt-Oxidation scheint ein einzigartiges Merkmal der alkalischen Phosphatase von E. coli zu sein. Weder Bacillus subtilis, von dem bekannt ist, dass er mehrere hochaktive Phosphatasen produziert (33), noch P. stutzeri, von dem bekannt ist, dass er eine Phosphatase produziert, die sich von BAP unterscheidet (in Stämmen, denen das Pt-Dehydrogenase-System fehlt) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson und W.W.M., unveröffentlichte Daten), können Pt als einzige P-Quelle nutzen (Abb. 3A ), obwohl beide Organismen auf Medien mit Phosphoserin als einziger P-Quelle wachsen (Daten nicht gezeigt). Somit sind die von diesen Organismen produzierten Phosphatasen nicht in der Lage, Pt in ausreichendem Maße zu oxidieren, um das Wachstum zu unterstützen. Wir untersuchten auch kommerzielle Zubereitungen von Kälberdarm-Phosphatase (CIP) und alkalischer Garnelenphosphatase (SAP) auf ihre Fähigkeit, Phosphat aus Pt zu produzieren (Abb. 3B ). Obwohl die eukaryotischen Phosphatasen nach einer Inkubation über Nacht geringe Mengen an Phosphat produzierten, war nur E. coli BAP in der Lage, die Reaktion in nennenswertem Umfang zu katalysieren. Dieses Ergebnis ist besonders überraschend, weil die eukaryotischen Enzyme eigentlich viel bessere Phosphatasen sind, mit spezifischen Aktivitäten, die bis zu 40-mal höher sind als die von BAP (27). Diese Enzyme weisen alle eine signifikante Homologie (25-35 % Identität) mit der E. coli BAP auf; darüber hinaus sind die meisten Reste der aktiven Seite, einschließlich Ser-102 (das während der Phosphatasereaktion ein kovalentes Phosphoenzym-Zwischenprodukt bildet), konserviert (27).
Pt-Oxidation ist einzigartig für die alkalische Phosphatase von E. coli. (A) Die Fähigkeit von B. subtilis und P. stutzeri, Pt zu oxidieren, wurde durch Wachstum auf Medien mit Pt als einziger P-Quelle getestet, wie in Abb. 1 beschrieben. Keiner der beiden Organismen wuchs auf dem Pt-Medium, während beide Organismen auf dem Phosphatmedium wuchsen. Obwohl also beide Organismen aktive Phosphatasen besitzen, kann keiner von ihnen Pt in ausreichendem Maße oxidieren, um das Wachstum zu unterstützen. P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) enthält Mutationen, die die beiden charakteristischen Pt-Oxidationswege dieses Organismus ausschalten, aber keine Auswirkungen auf die Phosphatase-Expression haben (9, 10). (B) BAP (alkalische Phosphatase aus E. coli), SAP (alkalische Phosphatase aus Garnelen; Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) und CIP (Kalbsdarm-Phosphatase; Sigma) wurden wie oben beschrieben auf Pt-Oxidation untersucht. In jedem Test wurden 56 μg der angegebenen Phosphatase verwendet, was 3 BAP-, 32 SAP- und 65 CIP-Phosphataseeinheiten entspricht, gemessen durch pNPP-Hydrolyse. Trotz der viel höheren Phosphatase-Aktivitäten der eukaryotischen Enzyme katalysierte nur BAP die Pt-Oxidation mit signifikanten Raten. Dargestellt ist der Durchschnitt von zwei Versuchen.
Es scheint plausibel, dass die Pt-Oxidation von BAP durch einen ähnlichen Mechanismus katalysiert wird wie bei der Phosphatesterhydrolyse (Abb. 4A ). Dementsprechend könnte Pt durch BAP mit einem Hydridanion als formale Abgangsgruppe hydrolysiert werden. Eine phoA-Mutante, bei der der Ser-102-Rest im aktiven Zentrum durch Alanin ersetzt wurde, ist nicht in der Lage, Pt als einzige P-Quelle zu nutzen, was darauf hindeutet, dass diese Aminosäure für die Phosphatester-Hydrolyse (27) und für die Pt-Oxidation erforderlich ist (Abb. 4B). Obwohl der direkte Hydridtransfer von einem Substrat zu einem wässrigen Proton biochemisch beispiellos ist, ist diese Reaktion angesichts des starken Reduktionspotentials des Phosphat-Pt-Paares (E o′ = -0,650 V) thermodynamisch sinnvoll. Daher ist die H-erzeugende Reaktion recht günstig: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (berechnet aus den Redoxpotentialen in Ref. 34). Sollte sich das hydrolytische Modell für die Pt-Oxidation als richtig erweisen, wäre dies eine sehr ungewöhnliche enzymatische Reaktion. Studien haben gezeigt, dass BAP auch in der Lage ist, Phosphodiester (35), Phosphoamide (36), Sulfatester (37) und Thiophosphat (38) zu hydrolysieren. Diese Reaktionen laufen jedoch wesentlich langsamer ab als die Pt-Hydrolysereaktion, obwohl sie viel bessere Abgangsgruppen beinhalten. Außerdem handelt es sich nicht um Redoxreaktionen. Die analoge Reaktion der Hydrolyse von Alkylphosphonsäuren wird nicht durch BAP katalysiert, wie sowohl biochemisch (39) als auch durch die Unfähigkeit von Δphn-Stämmen, diese Verbindungen als alleinige P-Quellen zu nutzen, gezeigt wurde (13).
Pt-Oxidation durch BAP kann durch Hydrolyse mit Hydridanion als Abgangsgruppe erfolgen. (A) Der chemische Mechanismus der Phosphatester-Hydrolyse durch BAP beinhaltet einen nukleophilen Angriff durch einen aktivierten Serinrest (Ser-102) auf den Phosphatester zur Bildung eines Phosphoserin-Enzymzwischenprodukts. Die Alkoxid-Abgangsgruppe erhält rasch ein Proton aus der Lösung, um den entsprechenden Alkohol zu bilden. Es scheint wahrscheinlich, dass die Pt-Oxidation durch einen ähnlichen Mechanismus mit einem Hydridanion als Abgangsgruppe erfolgt. (B) Die Rolle von Ser-102 bei der Pt-Oxidation wurde getestet, indem untersucht wurde, ob eine Mutante, die eine Ser-102-Ala-Mutation im phoA-Gen trägt, auf Pt-Medien wachsen kann, wie in Abb. 1 beschrieben. Die Mutante konnte auf Pt-Medium nicht wachsen, was zeigt, dass die aktive Stelle Ser-102 für die Pt-Oxidation erforderlich ist. Der Wirtsstamm war BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 und WM3611 tragen Einzelkopie-Integranten der Plasmide pKY1 und pKY2, die für das Wildtyp phoA-Gen (phoA+) bzw. die phoA-S102A-Mutante (Ser-102-Ala) kodieren.
Pt-Dehydrogenase (PtxD) war das einzige in vitro charakterisierte Enzym, das die Pt-Oxidation katalysierte (11). Obwohl die Einzelheiten der BAP-Reaktion noch nicht geklärt sind, unterscheiden sich die chemischen Mechanismen der beiden Enzyme deutlich. Während PtxD NAD als Elektronenakzeptor für die Redoxreaktion benötigt, benötigt die von BAP katalysierte Reaktion keine exogenen Elektronenakzeptoren, sondern nutzt die große thermodynamische Triebkraft der Reaktion, um in einer im Wesentlichen irreversiblen Reaktion ein stark reduziertes Produkt (H2) aus Wasser zu erzeugen (berechnetes K eq = 1,1 × 108). Alle anderen bekannten H2 produzierenden Reaktionen laufen viel näher am chemischen Gleichgewicht ab und sind in der Regel reversibel. Außerdem enthalten alle anderen bekannten Hydrogenasen entweder Fe oder Ni oder beides in ihren aktiven Zentren (40). Diese Beobachtung gilt auch für die so genannte „metallfreie“ H2-bildende Methylentetrahydromethanopterin-Dehydrogenase methanogener Archaeen, von der inzwischen bekannt ist, dass sie ebenfalls Fe enthält (41). Im Gegensatz dazu enthält BAP keine redoxaktiven Metalle, obwohl sowohl Zn als auch Mg für die hydrolytische Aktivität erforderlich sind (27). Die Behandlung von BAP mit Chelatoren hemmt die Pt-Oxidation, was darauf hindeutet, dass Metalle bei der Pt-Reaktion eine Rolle spielen (Daten nicht gezeigt).
Schließlich legen die hier vorgestellten In-vivo-Daten nahe, dass die Pt-Oxidationsreaktion biologisch relevant ist. Die Beobachtung, dass viele Bakterien Enzyme für die Pt-Oxidation besitzen, zeigt, dass diese Eigenschaft in mikrobiellen Populationen unter starkem Selektionsdruck steht (4, 5, 9, 42). Vor diesem Hintergrund ist es interessant festzustellen, dass die eukaryotischen Enzyme zwar viel bessere Phosphatasen sind, aber nicht zur Pt-Oxidation fähig sind. Diese Beobachtung wirft die Möglichkeit auf, dass sich E. coli BAP nicht als die effizienteste Phosphatase entwickelt hat, sondern als eine Phosphatase mit der Fähigkeit, Pt zu hydrolysieren. Dieser Gedanke steht im Einklang mit der merkwürdigen Beobachtung, dass E. coli BAP unter Phosphat-Starvationsbedingungen sehr stark exprimiert wird (bis zu 6 % des gesamten Zellproteins) (28). Die traditionelle Erklärung für dieses Phänomen ist, dass ein unbekanntes BAP-Substrat schlecht hydrolysiert werden muss und daher große Mengen des Enzyms benötigt werden, um konkurrenzfähige Wachstumsraten zu erzielen. Da sich jedoch die gemessenen Hydrolysegeschwindigkeiten für eine Vielzahl von Phosphatestersubstraten kaum unterscheiden (39, 43), scheint es unwahrscheinlich, dass dieses schlechte Substrat ein Phosphatester sein könnte. Im Gegensatz dazu ist die Geschwindigkeit der Pt-Hydrolyse wesentlich geringer als die Geschwindigkeit der Phosphatester-Hydrolyse, was darauf hindeutet, dass Pt das Substrat sein könnte, das für die extreme phoA-Expression verantwortlich ist, die in E. coli mit Phosphatmangel beobachtet wird.
Es ist klar, dass viele Details der BAP-Reaktion mit Pt noch zu klären sind. Die weitere Untersuchung dieser einzigartigen Reaktion wird wahrscheinlich nicht nur zu unserem Verständnis der P-Redox-Chemie und der Phosphoryl-Transfer-Reaktionen beitragen, sondern auch zu unserem Wissen über Hydrid-Transfer, H2 erzeugende Reaktionen und die Rolle reduzierter P-Verbindungen in der Natur.