2.19.2.3.3 Elutionsbedingungen
Effektive Elutionslösungen sollten idealerweise die Analyt-Antikörper-Wechselwirkungen unterbrechen, ohne die immobilisierten Abs zu beeinträchtigen. Ein Verdränger ist ein hochkonzentriertes kreuzreagierendes Molekül, das eine biospezifische Desorption hervorrufen kann. Die Verdrängermoleküle konkurrieren mit den gebundenen Analytmolekülen, und der große Überschuss an Verdränger gewährleistet eine quantitative Desorption des Analyten. Um eine optimale Leistung zu erzielen, muss der Verdränger mehrere Kriterien erfüllen: (1) eine hohe Kreuzreaktivität mit den immobilisierten Antikörpern, (2) eine Retentionszeit, die sich deutlich von der der Analyten unterscheidet, da der große Überschuss einen auffälligen Peak verursacht, der den Nachweis der Analyten leicht stören kann, (3) eine gute Stabilität und hohe Reinheit, da Verunreinigungen, die bereits in Mengen von 0,01-0,1 % vorhanden sind, das Chromatogramm stören können, und (4) ein niedriger Preis, ungiftige Eigenschaften, Abwesenheit in realen Proben und geringe Nachweisbarkeit im Vergleich zu den Analyten. Außerdem ist ein großes Volumen an Elutionslösung erforderlich, was eine Rekonzentration auf einem klassischen SPE-Träger vor der Analyse erforderlich macht. Daher werden Elutionsbedingungen bevorzugt, die eine vollständige Wiedergewinnung des Zielanalyten mit einem kleinen Elutionsvolumen ermöglichen.
Chaotrope Ionen werden üblicherweise für die Elution großer Moleküle wie Proteine verwendet. Diese Ionen stören die Wasserstruktur um große Moleküle, d. h. Antikörper und Zielmoleküle, wodurch die hydrophoben Wechselwirkungen in großen Molekülstrukturen und zwischen dem Analyten und dem Antikörper aufgebrochen werden. Die häufigsten chaotropen Ionen sind Chlorid-, Iodid-, Perchlorat- und Thiocyanat-Ionen in Konzentrationen zwischen 1,5 und 8 mol l-1. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die verschiedenen wässrigen Lösungen, die erfolgreich für die Desorption von Proteinen aus IS eingesetzt werden können, keine kleinen Moleküle desorbieren können. Die Desorption des Proteins beruht wahrscheinlich hauptsächlich auf Veränderungen in der Struktur des gebundenen Proteins (partielle Denaturierung) und nicht auf den Veränderungen in der Struktur der immobilisierten Antikörper. Daher sind für die Elution der kleinen Moleküle, die nicht auf Denaturierung reagieren, wesentlich strengere Bedingungen erforderlich. Darüber hinaus kann sich die Dissoziationskonstante der Antikörper-Analyt-Wechselwirkungen bei einer Temperaturerhöhung von 4 auf 43 °C um zwei Größenordnungen erhöhen. Diese Methode ist nicht effektiv genug, um für die Elution kleiner Moleküle eingesetzt zu werden. Die Elution mit Lösungen mit niedrigem pH-Wert wird häufig durchgeführt, um kleine Moleküle vom IS zu desorbieren, aber es sind drei pH-Einheiten vom isoelektrischen Punkt des Antikörpers erforderlich. Diese Art der Elution (Verschiebung des pH-Werts ohne Änderung der Ionenstärke) vermeidet die Schädigung labiler Antikörper. Ein Nachteil ist, dass für eine vollständige Desorption immer noch große Volumina erforderlich sind, wodurch die mit den Extraktionsverfahren verbundenen Anreicherungsfaktoren verringert werden.
Eine effiziente Elution kleiner Moleküle aus einem IS kann mit einem reduzierten Volumen eines Gemisches aus Wasser und organischen Modifikatoren erreicht werden. Als Beispiel zeigt Abbildung 6 das Elutionsprofil von zwei Herbiziden, Isoproturon und Atrazin, nach der Perkolation einer mit jedem Analyten dotierten Wasserprobe auf dem entsprechenden IS. Es wurden mehrere mit Wasser vermischte Elutionsmittel (Methanol, Ethanol und ACN) bewertet.
Abbildung 6. Elutionsprofile von Atrazin, Isoproturon, 2,4,6-Trichlorphenol und Pentachlorphenol aus ihren entsprechenden IS unter Verwendung von Elutionslösungen, die zunehmende Mengen eines organischen Lösungsmittels in angesäuertem oder nicht angesäuertem Wasser enthalten, nach der Perkolation von Wasserproben, die mit jedem Analyten dotiert sind. ACN, Acetonitril; MeOH, Methanol; EtOH, Ethanol; AA, Essigsäure; TFA, Trifluoressigsäure.
Die resultierenden Elutionsprofile hängen stark von der Art des Lösungsmittels ab. Die drei getesteten Lösungsmittel ermöglichen die vollständige Elution beider Analyten. ACN weist jedoch die höchste Elutionsstärke auf: der niedrigste Gehalt an diesem Lösungsmittel ermöglicht eine vollständige Elution beider Analyten. Ein ACN-Gehalt von 40 % bzw. 60 % reicht aus, um Isoproturon bzw. Atrazin zu gewinnen, während 60 % bzw. 80 % Methanol erforderlich sind. In diesem Fall scheint die Elutionsstärke des Lösungsmittels mit seiner hydrophoben Natur zusammenzuhängen, da ACN (Hildebrand-Löslichkeitsparameter δ = 24,3 MPa1/2) weniger polar ist als Ethanol (δ = 26,0 MPa1/2) und Methanol (δ = 29,7 MPa1/2). Diese Ergebnisse scheinen darauf hinzudeuten, dass die Wechselwirkungen zwischen den Herbiziden und den entsprechenden Antikörpern in erster Linie hydrophober Natur sind. Die Anwesenheit unpolarer Lösungsmittel reduziert die hydrophobe Bindungskomponente der Antikörper-Analyt-Wechselwirkung. Sie beeinträchtigt jedoch auch die Stabilität der hydrophoben Bindungen, wodurch die Tertiärstruktur des Antikörpers erhalten bleibt, und führt zur Freisetzung des Antigens. Diese Beispiele für die Elution von Atrazin oder Isoproturon aus den entsprechenden IS zeigen, dass eine effiziente Elution durch direkte Zugabe einer großen Menge Methanol oder ACN (70-80 %) in die Elutionsfraktion erreicht wird. Diese hohe Menge an organischem Modifizierungsmittel ermöglicht es, das Volumen der Elutionsfraktion so weit wie möglich zu reduzieren und so die Konzentration des Analyten im Eluat zu ermöglichen. Es muss darauf geachtet werden, dass die Wahl des Bindungsmodus mit diesen Elutionsbedingungen vereinbar ist. Durch die Verwendung nicht-kovalenter Bindungen ist es nicht möglich, eine so große Menge an Modifikator aufzubringen, ohne dass die Gefahr besteht, dass die Bindung der Antikörper an das Sorptionsmittel unterbrochen wird. Die Verwendung eines Sol-Gel-Verfahrens für die Immobilisierung von Antikörpern schränkt auch die Möglichkeit ein, eine große Menge organischer Lösungsmittel zu verwenden. Es wurde gezeigt, dass eine große Menge an organischen Modifikatoren wie Antikörper das Auslaugen von Antikörpern aus der Sol-Gel-Matrix verursacht.8
Eine Kombination aus organischem Lösungsmittel und organischer Säure ist manchmal erforderlich. Abbildung 6 zeigt auch das Elutionsprofil von 2,4,6-Trichlorphenol und Pentachlorphenol aus einem Anti-Pentachlorphenol-IS unter Verwendung eines hydro-organischen Gemischs mit und ohne Zusatz einer Säure zur Elutionslösung. Trichlorphenol konnte entweder mit Wasser/ACN (20:80, v/v) oder mit Wasser/ACN (30:70, v/v), das mit Trifluoressigsäure (TFA) auf pH 3 angesäuert wurde, vollständig zurückgewonnen werden. Wurde die Ansäuerung mit 1 % (v/v) Essigsäure (AA) durchgeführt, war eine Mischung mit nur 30 % ACN für die Elution wirksam. Im Gegensatz dazu war die Elution von Pentachlorphenol, das eine höhere Affinität zu den PAbs hat als Trichlorphenol, mit reinem ACN oder mit TFA angesäuertem ACN unmöglich. Die Desorption konnte nur mit Wasser/ACN 20:80 (v/v), das 1 % AA (v/v) enthielt, erreicht werden.
Daher wird bei den meisten Offline-Verfahren, einschließlich derjenigen, die unter Verwendung von kommerziellen Einweg-Inspektionssystemen empfohlen werden, die Desorption mit einem hohen Prozentsatz eines organischen Lösungsmittels erreicht, manchmal bei einem niedrigen pH-Wert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl der Elutionsbedingungen zunächst von der Affinität zwischen den Antikörpern und den Analyten abhängt. Sie hängt auch von der Art des Analyten ab, da das Verhältnis zwischen elektronischen und hydrophoben Wechselwirkungen bei den Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen eine Rolle spielt. Schließlich hängt es von der Strategie der Immobilisierung der Antikörper ab; die nicht-kovalente Bindung verhindert den Einsatz großer Mengen organischer Lösungsmittel.