Invasion Assay

Materialien:

Falcon 24 well tissueculture plate

Falcon Cell Culture Insert:8μm Porengröße, 24 Well Format

Cat# 3097

Matrigel (Verdünnt inDMEM/F12)

5% Glutaraldehyd in 1XPBS

0.5% Toluidinblau in 2% Na2CO3

Vorbereitung der Boyden-Kammer:

1. Mit einer sterilen Pinzette die Zellwandeinsätze aus der Verpackung nehmen und in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte einsetzen.
2. Waschen Sie die Einsätze 2 Mal mit 300μl DMEM/F12

(Achten Sie darauf, nicht in die Membran zu stechen)

1. Geben Sie 20μl 1:6 verdünntes Matrigel (2-3 mg/ml Protein) in die Mitte jedes Zellvertiefungseinsatzes. Verteilen Sie das Matrigel vorsichtig auf der gesamten Oberfläche der Membran.
2. Beschichtete Einsätze in den Inkubator stellen, damit das Matrigel 20-30 Minuten lang fest werden kann.

Vorbereitung der Zellen für den Test:

1. Zellen entsprechend den Versuchsbedingungen behandeln und wachsen lassen. Es kann wünschenswert sein, die Zellen auf den gleichen Wachstumszustand zu synchronisieren.
2. Trypsinieren und Zählen der Zellen
3. Trypsin entfernen und mit frischem Medium resuspendieren.
4. 1X105 Zellen in 200 μl definiertem Medium in die obere Kammer geben.
5. 300 μl des Mediums in die untere Kammer geben.
6. Kultur für etwa 20 Stunden.

Die Zeit variiert für verschiedene Zelllinien und kann bis zu 48 Stunden für weniger invasive Zellen betragen.

Fixierung und Färbung:

1. Nach der Kultur das Medium aus der unteren Kammer absaugen
2. 0,5 ml 5% Glutaraldehyd in 1XPBS zugeben, 10 Min. inkubieren. R.T
3. Glutaraldehydlösung ablüften lassen, jede Vertiefung dreimal mit D.W
4. 0,5 ml 0,5 %ige Toluidinblau-Färbelösung in die untere Kammer geben, 10-20 Min. inkubieren @ R.T
5. Lösung aus oberer und unterer Kammer ablüften lassen, untere Kammer dreimal mit D.W
6. Sorgfältig die Innenfläche der oberen Kammer mit einem Wattestäbchen abwischen. (Achten Sie darauf, nicht zu fest zu drücken, die Membran kann herausspringen.) Eingedrungene Zellen werden in der Mitte des Bodens der Membran sein.
7. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit dem q 20X Objektiv des Mikroskops. Zählen Sie mindestens 3 Felder pro Membran.