Abstract
Hintergrund. Bei der Amyloidose handelt es sich um extrazelluläre Ausfällungen von eosinophilem, hyalinem Material eigenen Ursprungs mit besonderen Färbungsmerkmalen und fibrillärer Ultrastruktur. Die makuläre Amyloidose ist auf die Haut beschränkt, und es wurden mehrere Faktoren für ihre Pathogenese vorgeschlagen. Der Nachweis von Epstein-Barr-Virus (EBV)-DNA in dieser Läsion deutet darauf hin, dass dieses Virus bei der Pathogenese dieser Krankheit eine Rolle spielen kann. Zielsetzung. Der Nachweis von EBV-DNA wurde bei 30 Hautproben mit der Diagnose einer makulären Amyloidose und bei 31 gesunden Hautproben am Rande von entfernten melanozytären Nävi mittels PCR durchgeführt. Ergebnisse. Bei den Patienten, die in der PCR positiv auf das Beta-Globin-Gen reagierten, war das BLLF1-Gen des EBV-Virus bei 23 Patienten positiv (8 Patienten in der Fallgruppe und 15 Patienten in der Kontrollgruppe). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Vorhandensein von EBV-DNA zwischen der Makula-Amyloidose-Gruppe (3,8%) und der Kontrollgruppe (23,8%) (). Schlussfolgerung. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass EBV nicht an der Pathogenese der Makula-Amyloidose beteiligt ist.
1. Einleitung
Amyloidose ist die extrazelluläre Ablagerung einer Gruppe von faserigen Proteinen. Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen zur Klassifizierung von Amyloidose, aber die einfachste Methode ist die Einteilung in systemische und organspezifische (lokalisierte) Typen. Bei beiden Typen ist die Haut ein betroffenes Gewebe. Bei der kutanen lokalisierten Amyloidose gibt es zwei Typen: (i) die keratinische, die primär oder sekundär sein kann, und (ii) die noduläre. Die sekundäre Amyloidose tritt sekundär zu anderen Hautläsionen wie Hauttumoren, entzündlichen Hauterkrankungen und Phototherapie auf. Es wurden zwei Arten der keratotischen Amyloidose unterschieden: die makuläre und die lichenartige Amyloidose, wobei letztere häufiger vorkommt. Bei der keratotischen Amyloidose sind die Keratinablagerungen, die von basalen Keratinozyten ausgehen, hauptsächlich CK5-positiv. Der keratotische Typ wird vor allem in Südostasien, Südamerika und China beobachtet. Es gibt familiäre (10 %) und sporadische Formen, wobei letztere häufiger bei Frauen vorkommen. Am häufigsten sind der obere Rücken (interscapularer Bereich) und die Extremitäten (Schienbeine und Arme) betroffen, aber auch das Gesicht, der Rumpf und die Oberschenkel wurden beschrieben. Makuläre Amyloidose-Läsionen treten in der Regel in Form von hyperpigmentierten Flecken mit unbestimmten Rändern auf, die aus graubraunen Makeln bestehen und oft ein netzartiges oder gekräuseltes Aussehen haben (Abbildung 1). Juckreiz ist ein häufiges Symptom vor dem Ausbruch der Amyloidose.
Die Pathogenese dieser Erkrankung ist nicht vollständig geklärt, außer der Tatsache, dass das abgelagerte Keratin von Keratinozyten stammt. Es wurden zwei pathogene Mechanismen vorgeschlagen, die apoptotische (fibrilläre) Theorie und die sekretorische Theorie. Nach der apoptotischen Theorie folgt auf die Degeneration der geschädigten Keratinozyten in der Basalschicht die Umwandlung dieser Kolloidkörper durch dermale Histiozyten und Fibroblasten in Amyloid in der papillären Dermis (Abbildung 2). Nach der sekretorischen Theorie breiten sich Amyloidablagerungen, die von degenerierten basalen Keratinozyten stammen, durch die beschädigte Lamina densa in die papilläre Dermis aus. Es gibt mehrere ätiologische Faktoren, die in die Pathogenese der makulären Amyloidose involviert sind: rassische Faktoren, genetische Prädisposition, Umweltfaktoren, Geschlecht (weiblich), weibliche Hormone, Exposition gegenüber Sonnenlicht, Reibung (langfristiger Abrieb), Atopie, Autoimmunität (basierend auf der Assoziation mit systemischem Lupus erythematodes, Dermatomyositis, systemischer Sklerose, Sarkoidose und IgA-Nephropathie) und Infektion mit EBV. EBV, dessen Vorhandensein in der Epidermis der makulären Amyloidose berichtet wurde, trägt wahrscheinlich zur Degeneration der Keratinozyten bei.
Die Rolle von EBV in der Ätiopathogenese der primären kutanen Amyloidose wurde bisher nur in zwei Studien untersucht, darunter ein einziger Fallbericht und eine Fallserie mit 27 Patienten aus China. In Anbetracht des Mangels an Studien über den Zusammenhang zwischen EBV und Makula-Amyloidose haben wir uns vorgenommen, eine diesbezügliche Studie im Iran durchzuführen. Vielleicht können antivirale Wirkstoffe in Zukunft zur Behandlung dieser Krankheit eingesetzt werden, wenn ein Zusammenhang mit EBV besteht.
2. Materialien und Methoden
In dieser Fall-Kontroll-Studie wurden 38 Makula-Amyloidose-Proben und 38 gesunde Hautproben um exzidierte melanozytäre Nävi von alters- und geschlechtsgleichen Patienten ohne Makula-Amyloidose in die klinische Untersuchung auf der Grundlage einer nicht zufälligen, objektiv orientierten Stichprobe aufgenommen. Zu den Einschlusskriterien gehörten Paraffinblöcke mit ausreichend Gewebe in den Archiven der Pathologieabteilung des Imam Reza Krankenhauses in Mashhad, bei denen aufgrund des pathologischen Berichts und der klinischen Präsentation eine Makula-Amyloidose diagnostiziert wurde. Zu den Ausschlusskriterien gehörten Blöcke mit unvollständigen Daten in den Aufzeichnungen und unzureichende Proben für die PCR.
In der Fallgruppe wurde die Amyloidablagerung durch optische Mikroskopie und Kongorot-Färbung bestätigt. Im nächsten Schritt wurden von den Blöcken der Fall- und der Kontrollgruppe unter sterilen Bedingungen mit einer sterilen Klinge jeweils sechs 5 μm große Schnitte angefertigt und in sterile Eppendorf-Röhrchen gegeben.
2.1. Entparaffinierung
Xylol/Ethanol wurde zur Entparaffinierung der paraffinierten Gewebe verwendet. Ein mL Xylol wurde in die Mikroröhrchen mit den Gewebeschnitten gegeben und eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bebrütet. Im nächsten Schritt wurden die Mikroröhrchen 10 Minuten lang bei 13.000 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Diese beiden Schritte wurden einmal wiederholt. Dem Niederschlag wurden 500 μl 100 %iges Ethanol zugesetzt und nach mehrmaligem Umdrehen der Mikroröhrchen 10 m lang bei 13 000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde anschließend entfernt. Dieser Schritt wurde noch einmal wiederholt. Schließlich wurde der entstandene Niederschlag bei Raumtemperatur gelagert, um das Ethanol vollständig zu verdampfen, nicht aber den Niederschlag.
2.2. DNA-Extraktion
Die DNA-Extraktion wurde mit dem BIO BASIC INC (Kanada) Kit mit der Chargennummer 8401-140116 durchgeführt. Für die Extraktion wurde Lysispuffer-T verwendet. Im nächsten Schritt wurden 100 μL Extraktionspuffer und 10 μL Proteinase K in jedes Mikroröhrchen gegeben und gemischt. Die Gewebeproben wurden in die Mischung gegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bebrütet. Anschließend wurden die Proben 3 Minuten lang bei 95 °C inkubiert, um die Proteinase K zu inaktivieren. 100 μl Universalpuffer NST wurden in die Röhrchen gegeben und 10 Mal umgedreht. Die erhaltene Mischung wurde für die PCR verwendet.
2.3. PCR
In dieser Studie wurde die PCR verwendet, um das Vorhandensein des EBV-Genoms bei Makula-Amyloidose nachzuweisen. Nach der DNA-Extraktion aus paraffinierten Blöcken wurde die Qualität der aus den in Paraffin eingebetteten Geweben extrahierten DNA mit Hilfe von Beta-Globin-Gen-Primern bestimmt. Die in dieser Studie verwendeten Primer für das Beta-Globin-Gen GH20 und PC04 amplifizierten ein Fragment von 260 bp. Die Sequenz dieser Primer lautete wie folgt: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.Die Proben, die das 260 bp Fragment mit den gewünschten Primern produzierten, wurden als günstig für die Amplifikation des EBV-Virus BLLF1-Gens angesehen.
Das Vorhandensein der EBV-Sequenz in den extrahierten DNA-Proben wurde mit dem Cinna Gen-Kit mit der Losnummer 935701 (Sina Clon, Iran) getestet. Dieser Kit wurde entwickelt, um die Qualität der EBV-DNA in infizierten Proben mittels PCR zu bestimmen. Als Reagenz wurde eine optimierte 1x PCR-Mischung aus rekombinanter Taq-DNA-Polymerase, PCR-Puffer, MgCl2, dNTPs und Primern verwendet. Die hochspezifische und repetitive Region des BLLF1-Gens, die für gp 350/220 kodiert, wird durch Primer amplifiziert. Sie können mindestens 30 Kopien von EBV nachweisen. Das Vorhandensein von 239 bp- oder 256 bp-Fragmenten zeigt ein positives Testergebnis an.
Die Datenanalyse wurde mit der Software SPSS 11.5 durchgeführt. Diagramme und statistische Tabellen wurden zur Beschreibung der Daten verwendet, und Chi-Quadrat-Tests und unabhängige Tests wurden zum Vergleich von EBV in den Proben von Gesunden und Patienten verwendet. Bei allen Tests wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 zugrunde gelegt.
3. Ergebnisse
Fünfzig Prozent der Patienten waren männlich (19/38) und 50% waren weiblich (19/38). Drei Patienten waren in der Altersgruppe unter 20 Jahren (7,9 %), 5 Patienten 20-30 Jahre (13,2 %), 10 Patienten 30-40 Jahre (26,3 %), 13 Patienten 40-50 Jahre (34,2 %), 4 Patienten 50-60 Jahre (10,5 %) und 3 Patienten über 60 Jahre (7,9 %). Das Mindest- und Höchstalter betrug 19 bzw. 76 Jahre. Es gab 27 Fälle von Infektionen am Rumpf (71,1 %) und 11 Fälle an den Extremitäten (28,9 %). Die Studien- und die Kontrollgruppe waren hinsichtlich Alter () und Geschlecht () identisch.
Bei 76 Proben (38 Fälle und 38 Kontrollen) wurde eine PCR für das Beta-Globin-Gen durchgeführt, die bei 61 Proben (30 Proben in der Fallgruppe und 31 in der Kontrollgruppe) positiv und bei 15 Proben (8 Proben in der Fall- und 7 in der Kontrollgruppe) negativ ausfiel (Abbildung 3).
In 61 Proben, die in der PCR positiv für das Beta-Globin-Gen waren, war das BLLF1-Gen von EBV in 23 Fällen positiv (8 Fälle in der Studiengruppe und 15 Fälle in der Kontrollgruppe) und in 38 Fällen negativ (22 Fälle in der Studiengruppe und 16 Fälle in der Kontrollgruppe) (Abbildung 4).
Die PCR des BLLF1-Gens von EBV war in der Studiengruppe zu 26,7 % und in der Kontrollgruppe zu 48,4 % positiv. Die Ergebnisse des Chi-Quadrat-Tests zeigten keine Korrelation zwischen EBV und Makula-Amyloidose () (Tabelle 1).
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4. Diskussion
Amyloidose ist bekannt als extrazelluläre Ablagerung von eosinophilem hyalinem Material eigenen Ursprungs mit spezifischen Färbe- und Ultrastrukturmerkmalen. Diese Störung kann vor dem Hintergrund systemischer Erkrankungen auftreten oder auf die Haut beschränkt sein. Die makuläre Amyloidose ist auf die Haut beschränkt. EBV kann die Sekretion von Amyloidmaterial durch Keratinozyten stimulieren oder ein Stimulus für die Degeneration von Keratinozyten und die Umwandlung von degenerierten Keratinozytenfilamenten in Amyloid sein. Jüngste Studien haben auf die Rolle von Epithelzellen bei der fortgesetzten Reproduktion von EBV hingewiesen. EBV-Zelloberflächenrezeptoren, die in weniger differenziertem Plattenepithel gefunden wurden, deuten auf eine direkte Infektion von epidermalen Keratinozyten hin. Eine Infektion kann in den Keimschichten erfolgen; eine Virusreplikation ist jedoch nur durch Reifung und Differenzierung der Zellen möglich. Die Expression von Cytokeratin in menschlichen Keratinozyten wird in vitro nach einer Infektion mit EBV verändert, was zu ihrer Umwandlung in Fibroblasten führt. Fibroblasten können Keratin-Aggregate phagozytieren und in Amyloid umwandeln.
Drago et al. zeigten diesen Zusammenhang 1996 in Italien. Bei ihrer Patientin handelte es sich um eine 30-jährige Frau, die seit zehn Jahren an juckenden braunen Papeln und Makeln auf Brust und Rücken mit Symptomen eines chronischen Müdigkeitssyndroms litt. Sie konnten das EBV-Genom in epidermalen Läsionen mittels In-situ-Hybridisierungstechnik nachweisen. Das EBV-Genom wurde vor allem in den basalen Epidermiszellen sowie in den Zellen der höheren Schichten nachgewiesen, insbesondere im Zytoplasma. Serologische Tests auf EBV waren bei dem Patienten ebenfalls positiv. Eine antivirale Therapie mit Aciclovir und Interferon alpha verbesserte die Hautläsionen und die allgemeinen Symptome des Patienten. Eine weitere Studie wurde von Chang et al. 1997 in Taiwan an Hautgewebe von 27 Patienten mit einer Diagnose von Lichen und makulärer Amyloidose durchgeführt. Die In-situ-Hybridisierungsmethode wies EBV-DNA in den Läsionen von 11 Patienten (40,7 %) nach, während in der Kontrollgruppe (zu der drei Patienten mit sekundärer kutaner Amyloidose, zwei Patienten mit primärer systemischer Amyloidose und vier Patienten mit chronischer Simplex-Flechte gehörten) keine EBV-DNA nachweisbar war.
Nach dieser Studie gab es keine Korrelation zwischen EBV und makulärer Amyloidose (). In unserer Studie war EBV-DNA bei 8 Patienten mit Makula-Amyloidose und 15 Kontrollen vorhanden. Der Unterschied in der Nachweisrate von EBV-DNA zwischen Makula-Amyloidose-Patienten und Kontrollen in dieser Studie im Vergleich zu den genannten Studien kann auf folgende Gründe zurückzuführen sein:(1) Fehlender Zusammenhang zwischen Makula-Amyloidose und EBV-Infektion: Es gibt einige wenige Studien, die keine ausreichenden Beweise für einen definitiven Zusammenhang zwischen EBV und Makula-Amyloidose liefern, so dass wir auf der Grundlage der Ergebnisse unserer Studie diese Schlussfolgerung ziehen konnten.(2) Methodik (PCR versus In-situ-Hybridisierung): Wir haben eine empfindliche Methode zum Nachweis von EBV-DNA mit positiven und negativen Kontrollen verwendet. Ausgehend von früheren Studien ist die PCR ebenso empfindlich wie die In-situ-Hybridisierung. Da wir jedoch keine In-situ-Hybridisierung verwendet haben, konnten wir die mit EBV infizierten Zellen in unseren Kontrollen nicht genau lokalisieren, bei denen es sich um zirkulierende B-Zellen der Haut und nicht um Keratinozyten handeln könnte. Da wir in unserem PCR-Kit für EBV Positiv- und Negativkontrollen verwendeten, konnten die positiven Fälle in unserer Kontrollgruppe nicht falsch positiv sein.(3) Kontrollen: Die Kontrollen in unserer Studie waren die gesunde Haut um melanozytäre Nävi, aber die Kontrollen in der Chang-Studie waren andere Hauterkrankungen.(4) Art der kutanen Amyloidose: In unserer Studie hatten alle Patienten eine makuläre Amyloidose, aber in den beiden früheren Studien waren die meisten Patienten von Lichen amyloidosis.
5. Schlussfolgerung
Nach den Ergebnissen dieser Studie gab es keine Korrelation zwischen EBV und Makula-Amyloidose. Wir empfehlen die Verwendung von frischem Gewebe oder einer schnell eingefrorenen Biopsiestanze sowie die gleichzeitige serologische Untersuchung der Patienten auf Anti-EBV-Antikörper, um genauere Ergebnisse für eine vergleichende Untersuchung der EBV-DNA bei Makula-Amyloidose zu erhalten. Die In-situ-PCR kann auch zur Lokalisierung der EBV-DNA-positiven Zellen in den Proben verwendet werden. Andere Gene können zum Nachweis von EBV im Gewebe verwendet werden, da einige EBV-Proben für das in dieser Studie verwendete BLLF1-Gen mutiert sind.
Außerdem empfehlen wir die Durchführung einer vergleichenden Studie zum Nachweis von EBV in der betroffenen und nicht betroffenen Haut von Patienten mit Makula-Amyloidose.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Danksagungen
Die Autoren sprechen dem Forschungsbeauftragten der MUMS ihre tiefe Dankbarkeit für die finanzielle Unterstützung und die Genehmigung des Forschungsantrags (Nr. 911283) für die Dissertation von Narges Nazeri aus. Die finanzielle Unterstützung durch den Forschungsbeauftragten der Mashhad University of Medical Sciences wird anerkannt.