Natriumazid induziert Mitochondrien-vermittelte Apoptose in PC12-Zellen durch den Pgc-1α-assoziierten Signalweg

Einführung

Als weißes, farbloses und kristallines Pulver wird Natriumazid (NaN3) als hochgiftiger Stoff eingestuft. Seine toxischen Wirkungen ähneln denen von Zyanid und schädigen das Nerven- und Herz-Kreislauf-System, die Augen und die Haut. Dieses toxische Element wird nach der Einnahme schnell aktiv, und seine Hauptwirkungen treten je nach der aufgenommenen Menge mehrere Stunden nach der oralen Aufnahme auf (1,2). Die Exposition gegenüber NaN3 kann innerhalb von Minuten eine Reihe von Symptomen hervorrufen, darunter Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen, Unruhe, Schwindel, Schwäche, schnelle Atmung und schneller Herzschlag (3). Hohe Mengen dieses toxischen Elements führen sofort zu Krämpfen, Bewusstlosigkeit, niedriger Herzfrequenz und niedrigem Blutdruck sowie zum Versagen der Atmung, was schließlich zum Tod führt (3). Von den nachgewiesenen Wirkungsmechanismen von NaN3 ist der wichtigste die Hemmung des Cytochromoxidase-Atmungskettenkomplexes (4). Frühere Studien haben gezeigt, dass NaN3, ein Inhibitor von Komplex IV (Cox IV), die Apoptose in primären kortikalen Neuronen auslösen kann, die von Caspase-3 abhängt und mit der Freisetzung von Cytochrom c verbunden ist (5).

In der mitochondrialen Biosynthese kann der Promotor der Atmungskette Cox IV durch nukleare Atmungsfaktoren (Nrf)-1/2 aktiviert werden. Gleichzeitig kann Nrf durch die Regulierung der Aktivität von Genen, die für den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (Tfam) kodieren, angepasst werden, um indirekt die Expressionsniveaus von Atmungskettengenen zu regulieren. Nrf-1/2, Tfam, der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-γ-Koaktivator 1-α (Pgc-1α) und andere Koaktivatoren bilden die Pgc-1α-Signalkaskade, die eine zentrale Rolle in einem regulatorischen Netzwerk spielt, das die transkriptionelle Kontrolle der mitochondrialen Biogenese und der Atmungsfunktion steuert. In dieser Signalkaskade aktiviert Pgc-1α zunächst Nrf-1/2, anstatt direkt an die mitochondriale DNA zu binden, und Nrf-1/2 induziert die Aktivierung von Tfam in Kombination mit dem Promotor von Tfam und löst die Transkription und Replikation der mitochondrialen DNA aus, was zu einer erhöhten Expression mitochondrialer Proteine führt(6). Gleichzeitig kann Pgc-1α durch CaN-, Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaMK), Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) und Cyclin-abhängige Kinase-vermittelte Signalwege aktiviert werden (7). In der vorliegenden Studie wurden PC12-Zellen verwendet, um ein Dopamin-Neuronen-Modell zu erzeugen, und die Auswirkungen und der Mechanismus von NaN3 auf die Pgc-1α-assoziierten Signalwege in PC12-Zellen wurden untersucht, um festzustellen, ob NaN3 in kultivierten PC12-Zellen Toxizität induziert und welche Mechanismen diesen Auswirkungen zugrunde liegen.

Materialien und Methoden

Materialien

Ratten-Pheochromozytom-PC12-Zellen wurden von der Cell Bank of Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) erworben. Die Stammlösung von NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) wurde in der sterilen Kochsalzlösung aufgelöst, um eine 1-M-Stammlösung herzustellen, die anschließend vor den Experimenten auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt wurde. Ein einstufiges TUNEL-Apoptose-Assay-Kit (C1090), Annexin V-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Apoptose-Detektions-Kit (C1063), Enhanced Adenosin 5′-Triphosphat (ATP)-Assay-Kit (S0027), JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (C2006) und Reactive Oxygen Species Assay Kit (S0033) wurden vom Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China) bereitgestellt.

Zellkultur und Lebensfähigkeitstest

PC12-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, USA) und 1 % antibiotischer antimykotischer Lösung, bestehend aus 10.000 U Penicillin und 10.000 U Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bebrütet und immer bei 70-80 % Konfluenz verwendet.

Die Lebensfähigkeit der PC12-Zellen wurde mit einem Zellzählungs-Kit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Shanghai, China) bestimmt. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1×105/Well ausgesät. Nach 24 Stunden Kultur wurden die Zellen mit NaN3 (0-80 mM) behandelt und 12, 24, 48 und 72 Stunden lang inkubiert, um das Modell der Zellschädigung zu etablieren. Anschließend wurden 10 µlCCK-8-Lösung (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) in jede Vertiefung gegeben und weitere 2 Stunden unter Standardbedingungen (37°C und 5% CO2) inkubiert. Die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm wurde mit dem ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) bestimmt. Die Zellviabilität wurde anhand der mittleren optischen Dichte von 6 Vertiefungen berechnet. Die Versuche wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die geeigneten NaN3-Konzentrationen für die nachfolgenden Experimente wurden anhand der Ergebnisse der Zellviabilitätsversuche bestimmt.

Kernmorphologie von DAPI-gefärbtenPC12-Zellen

PC12-Zellen wurden 24 Stunden lang 0, 10, 20 und 40 mMNaN3 ausgesetzt. Um den programmierten Zelltod vom nicht-apoptotischen Zelltod zu unterscheiden, wurden die Zellkerne mit 10 µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology) gefärbt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann 30 Minuten lang mit 4%igem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die fixierten Zellen 5 Minuten lang mit DAPI (1:5.000) angefärbt und anschließend mit PBS gewaschen. Fluoreszenzbilder wurden mit einem Leica DMI-Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung ×400) aufgenommen.

Messung der Apoptoserate

Ein Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Detektionskit (Beyotime Institute of Biotechnology) wurde verwendet, um die Apoptose von Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.Experimente wurden in dreifacher Ausführung wiederholt und wie folgt durchgeführt: Die Apoptoseraten von Kontroll-PC12-Zellen (0 mMNaN3) und PC12-Zellen, die 24 Stunden lang 10, 20 und 40 mMNaN3 ausgesetzt waren, wurden mittels Durchflusszytometrie (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA) gemessen. Statistische Analysen wurden mit der SPSS-Statistiksoftware v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt.

Die Messung des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm)

ΔΨm ist ein wichtiger Parameter der Mitochondrienfunktion. Er wurde durch Färbung mit JC-1, einer Fluoreszenzprobe, bestimmt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung wiederholt und wie folgt durchgeführt: Die PC12-Kontrollzellen wurden mit 0 mM NaN3 behandelt; die experimentellen PC12-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 10, 20 und 40 mM NaN3 behandelt. Anschließend wurden die Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers (C2006; Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China) 20 Minuten lang bei 37 °C mit dem JC-1-haltigen Medium (1X) inkubiert, dreimal mit Waschpuffer gewaschen und mit frischem Medium ohne Serum gesammelt. Gleichzeitig wurde die Positivkontrolle mit Carbonylcyanid-3-chlorphenylhydrazon (CCCP), einem Inhibitor, (10 µM) bei 37°C für 20 Minuten behandelt. Anschließend wurde die Rot/Grün-Fluoreszenz mittels FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.) bestimmt. Das Verhältnis der roten Fluoreszenzintensität zur grünen Fluoreszenzintensität repräsentierte das Niveau von ΔΨm.

Die Messung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

ROS in PC12-Zellen wurde mit einem Assay-Kit für reaktive Sauerstoffspezies (S0033; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China) bestimmt. Die intrazelluläre ROS-Erzeugung wurde mit 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA), einer Fluoreszenzsonde, gemessen. Intrazelluläre ROS oxidieren DCFH-DA, wodurch die fluoreszierende Verbindung 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF) entsteht, und die DCF-Fluoreszenzintensität wird gemäß den Anweisungen des ROS-Assay-Kits als parallel zur Menge der gebildeten ROS betrachtet.Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung wiederholt und wie folgt durchgeführt: Die Positivkontrolle wurde mit einer bestimmten Konzentration von Rosup (50 mg/ml) behandelt; die Kontroll-PC12-Zellen wurden mit 0 mMNaN3 behandelt; und die experimentellen PC12-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 10, 20 und 40 mM NaN3 behandelt. Außerdem wurden die PC12-Zellen 20 Minuten lang bei 37°C mit DCFH-DA (10 mM), gelöst in serumfreiem DMEM (1:1.000), behandelt und anschließend dreimal mit serumfreiem DMEM gewaschen. Die Positivkontrolle wurde mit Rosup behandelt, um die ROS-Produktion zu induzieren. Die ROS-Produktion wurde mittels FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.) bestimmt. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) stellten die ROS-Werte dar.

Messung des zellulären ATP-Gehalts in PC12-Zellen

Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung wiederholt und wie folgt durchgeführt: Kontroll-PC12-Zellen wurden mit 0 mMNaN3 behandelt; und experimentelle PC12-Zellen wurden 24 h lang mitNaN3 in verschiedenen Konzentrationen (10, 20 und 40 mM) behandelt. Anschließend wurde der zelluläre ATP-Gehalt mit einemFirefly Luciferase ATP Assay Kit (Beyotime Institute ofBiotechnology) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt.

Western-Blot-Analyse

PC12-Zellen wurden 24 h lang 0, 10, 20 und 40 mMNaN3 ausgesetzt, in Radioimmunopräzipitations-Assay-Lysepuffer (Beyotime Institute of Biotechnology), der Aprotease-Inhibitor enthält, lysiert und bei 13.362 × g für 10 min bei 4°C zentrifugiert, um die Überstände zu sammeln. Anschließend wurden die Proteinkonzentrationen mit dem BCA-Kit (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.) bestimmt. Gleiche Mengen an Proteinen (90 µg) wurden einer 10- und 12%igen SDS-PAGE unterzogen und anschließend mit einer Semidry-Elektrotransfereinheit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) auf Polyvinylidenfluorid-Membranen (0,45 µm) übertragen. Nach der Blockierung mit 5 % Rinderserumalbumin in TBS mit 0.1% Tween-20 (TBST) für 2 h bei Raumtemperatur wurden die Membranen mit primären Antikörpern gegen Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1.000), Tfam (Abcam; 1:1.000), Procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc., Danvers, MA, USA, 1:500), pan-Calcineurin A (CaN; Cell Signaling Technology Inc.; 1:1.000), phosphoryliertes (p)-CaMKII (Cell Signaling Technology; 1:1.000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1.000), p-extrazelluläre signalregulierte Kinase (Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1.000), B-Zell-Lymphom-2 (Bcl-2)-assoziiertes X-Protein (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) und Cytochrom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) bei 4°C über Nacht. Die Membranen wurden anschließend mit TBST gewaschen und mit an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten sekundären Antikörpern (Kaninchen; Kat.-Nr. A0208; 1:1.000; oder Maus; Kat.-Nr. A0216; 1;1.000; beide Beyotime Instituteof Biotechnology) für 1 h bei Raumtemperatur. Die immunreaktiven Banden wurden mit dem verstärkten Chemilumineszenzsystem (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, China) sichtbar gemacht und mit Image J Version l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA) quantitativ analysiert, und β-Actin wurde als Ladekontrolle ausgewählt.

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit der SPSS-Statistiksoftware v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ± Standardfehler des Mittelwerts angegeben. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde durch Einweg-Varianzanalyse und anschließende Bonferroni-Post-hoc-Tests ermittelt. P<0,05 wurde als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied betrachtet. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt.

Ergebnisse

NaN3 hemmt das Wachstum von PC12-Zellen

Die Wirkung der NaN3-Exposition auf die Proliferation von PC12-Zellen wurde mit dem CCK-8-Assay bewertet. Die Zellen wurden 12-72 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen (0-80 mM) von NaN3 konfrontiert. Tabelle I und Abb. 1A-D zeigen, dass die Lebensfähigkeit der Zellen durch NaN3 in einer konzentrationsabhängigen Weise verringert wurde. Nahezu 100 % der Zellen starben nach 72-stündiger Exposition mit 80 mM NaN3 ab, was darauf hindeutet, dass NaN3 den Zelltod deutlich auslöste, und die Zytotoxizität von NaN3 wurde dosis- und zeitabhängig nachgewiesen. Die Exposition gegenüber NaN3 in einer Konzentration von 20 mM für 24 Stunden verursachte einen deutlichen Zelltod in den PC12-Zellen (50 %). Daher wurden die für 24 h kultivierten Zellen für die nachfolgenden Experimente verwendet.

Tabelle I.

NaN3 unterdrückt das Wachstum von PC12-Zellen (n=6).

Zellmorphologie

Bei der DAPI-Färbung wurden die morphologischen Veränderungen der PC12-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, nachdem sie verschiedenen Konzentrationen von NaN3 ausgesetzt waren. Die Fragmentierung der Zellkerne, die 24 Stunden lang NaN3 ausgesetzt waren, wurde beobachtet, und die Schrumpfung der Zellkerne und die Chromatinkondensation nahmen mit der Konzentration von NaN3 in PC12-Zellen im Vergleich zur Kontrolle leicht zu. In diesen Zellen waren apoptotische Zellen im Vergleich zu normalen Zellen kleiner und heller. Darüber hinaus waren die Anzahl der apoptotischen Zellen und die Intensität der grünen Fluoreszenz in den Zellen, die NaN3 ausgesetzt waren, erhöht (Abb. 2).

Bestimmung der apoptotischen Rate durch Annexin V-FITC-Färbung

Tote Zellen oder spät apoptotische Zellen, die ihre Zellmembranintegrität verloren haben, können mit Propidiumiodid angefärbt werden. Aufgrund des Verlustes dieser Zellmembranintegrität kann Annexin V-FITC in das Zytoplasma eindringen und sich mit dem Phosphatidylserin innerhalb der Zellmembran verbinden, was zu einer grünen Fluoreszenz in toten Zellen führt.Abb. 3 zeigt, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen 5,03, 8,02, 43,77 und 78,67 % (P<0,05) in den PC12-Zellen betrug, nachdem sie 24 Stunden lang NaN3 in verschiedenen Konzentrationen (0, 10, 20 und 40 mM) ausgesetzt waren. Diese Ergebnisse bestätigten außerdem, dass NaN3 dosisabhängig die Zellapoptose auslöst.

Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm)

Mitochondrien werden im Allgemeinen als wichtige regulatorische Organellen betrachtet, die an der Lebensfähigkeit von Zellen beteiligt sind. Daher wurde ΔΨm als Indikator für die mitochondriale Funktion verwendet. PC12-Zellen wurden mit JC-1 angefärbt, einem kationischen Farbstoff, der eine potenzialabhängige Anreicherung in Mitochondrien aufweist. Eine rote Fluoreszenz (J-Aggregate), die für aktive Mitochondrien mit stabilem Membranpotential steht, wurde in einer kleinen Anzahl von Zellen beobachtet, die steigenden Konzentrationen von NaN3 ausgesetzt waren. Im Gegensatz dazu wurde in einer Reihe von Zellen eine grüne Fluoreszenz (J-Monomer) beobachtet, die für apoptotische Mitochondrien mit beschädigtem ΔΨm steht. Das Verhältnis von roter und grüner Fluoreszenz nahm in der Kontrollgruppe allmählich ab (Abb. 4).

NaN3-induzierte Anhäufung mitochondrialer ROS

Es ist bekannt, dass Mitochondrien die primäre Quelle für zelluläre ROS sind und ROS eine wichtige Rolle bei der Inaktivierung apoptotischer Signale spielen. Daher wurde die Rolle von ROS beim durch NaN3 induzierten Zelltod von PC12 zusätzlich untersucht. Abb. 5 zeigt, dass die Fluoreszenzintensitäten in Kontrollzellen und Zellen, die 24 Stunden lang NaN3 in verschiedenen Konzentrationen (0, 10, 20 und 40 mM) ausgesetzt waren, 3,65, 6,99, 18,63 und 39 betragen.35, was darauf hindeutet, dass die NaN3-Exposition die Produktion von mitochondrialem ROS im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöhte (P<0,05). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NaN3-induzierte Apoptose die Produktion von intrazellulärem ROS verbesserte.

NaN3 reguliert die mitochondriale Energieproduktion von zellulärem ATP

Um den ATP-Gehalt in PC12-Zellen zu bewerten, die NaN3 ausgesetzt waren, wurde die relative Lumineszenzeinheit (RLU) quantitativ mit einem Luminometer bestimmt. Abb. 6 zeigt, dass NaN3 die mitochondriale ATP-Produktion hemmte und den zellulären ATP-Gehalt allmählich verringerte (P<0,05).

Expressionslevel von Pgc-1α und Apoptose-assoziierten Proteinen in PC12-Zellen

Die Pgc-1α-Expression auf Proteinebene war nach NaN3-Exposition im Vergleich zur Kontrolle signifikant verringert (P<0,05). Darüber hinaus sind Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2, Nrf-2 und Cox IV bekannte nachgeschaltete Ziele der Pgc-1α-Dynamik in verschiedenen Zelltypen (8). In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass die NaN3-Exposition die Pgc-1α-Dynamik signifikant in einer dosisabhängigen Weise hemmte (P<0,01; Abb. 7A).

Darüber hinaus erhöhte die NaN3-Exposition die Expressionswerte von Bax und Cytochrom c, während sie die Expressionswerte von Bcl-2 und Procaspase-3 herunterregulierte (P<0,05). Das Verhältnis von Bax/Bcl-2 war im Vergleich zur Kontrollgruppe ebenfalls signifikant erhöht (P<0,05; Abb. 7B).

Die Proteinexpressionsniveaus von anderen wichtigen Mitgliedern, einschließlich CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK und p-p38 MAPK, wurden ebenfalls bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass NaN3 die Expression von CaN und die Phosphorylierung von CaMKII und p38 MAPK im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte, während die Expressionsniveaus der gesamten CaMKII und p38 MAPK nicht verändert wurden. Darüber hinaus waren die Verhältnisse von p-CaMKII/CaMKII und p-p38/p38 MAPK in der NaN3-Gruppe im Vergleich zu denen in der Kontrollgruppe signifikant erhöht (P<0,01; Abb. 7C).

Diskussion

Um festzustellen, ob NaN3 die Proliferation von PC12-Zellen hemmt, wurde die Anzahl der behandelten Zellen in der logarithmischen Phase mit der Anzahl der unbehandelten Kontrollzellen verglichen. Das Zellwachstum wurde nach 24 Stunden Exposition mit 20 mM NaN3 um ~75 % gehemmt. Daher wurde diese Konzentration für die nachfolgenden Experimente verwendet. Bei der Apoptose kommt es zu Veränderungen der Zellmorphologie, wie z. B. Membranblasen, Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, Kernfragmentierung und DNA-Fragmentierung(9). Um zusätzlich die Kernmorphologie der Apoptose und die Apoptoserate zu analysieren, wurden die Zellen 24 Stunden lang mit 0, 10, 20 und 40 mM NaN3 behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit DAPI und AnnexinV-FITC/PI angefärbt, und die Verteilung der Kerne wurde analysiert. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Exposition mit NaN3 die Apoptose in PC12-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise auslöste.

Mitochondrien sind an zahlreichen Stoffwechselfunktionen beteiligt, einschließlich der Aufrechterhaltung des intrazellulären pH-Wertes und der Produktion von ROS, die die Zellapoptose fördern und regulieren (10). Den Merkmalen der Zellapoptose gehen mitochondriale Veränderungen voraus, darunter ein Verlust von ΔΨm, eine Verringerung der Energieproduktion (ATP) und eine Erhöhung der Permeabilität der Mitochondrienmembran. Frühere Studien haben nahegelegt, dassROS Schäden an der mitochondrialen Atmungskette auslösen und den Verlust von ΔΨm verursachen, was die Faktoren sind, die die neuronale Dysfunktion im Verlauf der Neurodegeneration vermitteln oder verstärken und folglich zur Entwicklung von neurodegenerativen Erkrankungen führen (11,12).Es ist bekannt, dass NaN3 die Degeneration und Exzitotoxizität fördert, indem es das Permeabilitätspotenzial der mitochondrialen Membran durch Lipidperoxidation erhöht (13-15), und NaN3 übt seine primäre toxische Wirkung aus, indem es die Funktion der Cytochromoxidase in der mitochondrialen Elektronentransportkette hemmt und die ATP-Produktion verhindert (4). In der vorliegenden Studie wurde die FCM zur Identifizierung von ΔΨm und der ROS-Produktion in PC12-Zellen verwendet. Darüber hinaus wurde die ATP-Synthese in Mitochondrien nach Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von NaN3 untersucht. Die Störung der Plasmamembran, der Anstieg der mitochondrialen ROS-Produktion und die beobachtete Abnahme des zellulären ATP-Gehalts deuteten darauf hin, dass die NaN3-Exposition die Apoptose in PC12-Zellen auslöste.

Der mitochondriale Zelltod kann durch verschiedene Stimuli ausgelöst werden, darunter das Entwicklungsprogramm, DNA-Schäden, Stress des endoplasmatischen Retikulums, Wachstumsfaktor- und Nährstoffentzug, virale Infektionen und oxidativer Stress (16). Als Mitglied der ständig wachsenden Familie der nukleären Co-Regulatoren kann Pgc-1α eine Vielzahl von Genen aktivieren und die Expression von Genen regulieren, die am Energiestoffwechsel beteiligt sind, und zwar als Reaktion auf Signalwege, die die Thermogenese, die Gluconeogenese, die Umschaltung des Muskelfasertyps und die mitochondriale Biogenese vermitteln (17).Diese Co-Regulatoren existieren und funktionieren in großen Multiproteinkomplexen, in denen sie nicht an die DNA binden, sondern Nrf-1/2 und Tfam regulieren und ihre transkriptionelle Potenz modulieren, indem sie die nachfolgenden biochemischen Interaktionen fördern, die für die Induktion oder Unterdrückung der Gentranskription erforderlich sind (8). Darüber hinaus steuert Nrf-1/2 indirekt die Expression mitochondrialer DNA-kodierter Gene, indem es die kernkodierten Tfam A, B1 und B2 (Tfam, Tfb1m bzw. Tfb2m) induziert, die die Transkription und Replikation des mitochondrialen Genoms regulieren (18). Frühere Studien haben gezeigt, dass NaN3 ein Inhibitor des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes IV ist, der häufig bei primären mitochondrialen Erkrankungen betroffen ist (19,20).In der vorliegenden Studie wurde zunächst die Expression der Pgc-1α-Signalkaskade, einschließlich der Proteine der Pgc-1α-Familie (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 und Tfam) und Cox IV, in PC12-Zellen untersucht, um zu überprüfen, ob die Signalereignisse an der NaN3-induzierten Apoptose beteiligt sind. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die NaN3-induzierte Apoptose mit den Expressionsniveaus der Proteine der Pgc-1α-Familie und Cox IV im Mitochondrien-vermittelten Signalweg verbunden war. Wenn die Konzentrationen von NaN3 erhöht wurden, verringerten sich die Expressionsniveaus dieser Proteine signifikant, was darauf hindeutet, dass sie an der Aktivierung und Entwicklung der Apoptose beteiligt sein könnten.

Umgekehrt kann Komplex IV die Apoptose in primären kortikalen Neuronen auslösen, die Caspase3-abhängig ist und mit der Freisetzung von Cytochrom c einhergeht (5). Es ist bekannt, dass die Mitochondrien wichtige Regulatoren der Zellapoptose sind. Die Proteine der Bcl-2-Familie sind die wichtigsten Initiatoren des mitochondrialen Apoptosewegs. Zu dieser Familie gehören die pro-apoptotischen Proteine Bax, Bcl-2 homologer Antagonist/Killer und Bcl-2-assoziierter Agonist des Zelltodes sowie die anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-extra large (Bcl-xL). In gesunden Zellen ist Bax ein inaktives zytosolisches Protein, das jedoch während der Apoptose in die Mitochondrien verlagert wird. Es übt seine pro-apoptotische Wirkung aus, indem es eine Pore in der mitochondrialen Außenmembran bildet, durch die Cytochrom c in das Zytoplasma freigesetzt wird, was zur Aktivierung von Caspase 3 führt (21). Die anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL unterdrücken die Funktion von Bax, indem sie die Integrität der mitochondrialen Membran aufrechterhalten, was die Freisetzung von Cytochrom und die Aktivierung von Caspase 3 verhindert (22). In der vorliegenden Studie erhöhte NaN3 den Gehalt an pro-apoptotischem Bax und Cytochrom c und verringerte den Gehalt an anti-apoptotischem Bcl-2 und Procaspase-3, was darauf hindeutet, dass NaN3 die mitochondriale Apoptose-Signalisierung in PC12-Zellen initiiert.

Darüber hinaus sind die Expressionsniveaus von Pgc-1α-Co-Aktivatoren auf transkriptioneller Ebene über eine Vielzahl von vorgelagerten Signalwegen in hohem Maße induzierbar. Beispielsweise wird die Expression von Pgc-1α durch Bewegung und Kälteexposition unter der Kontrolle von Stresssignalen über zelluläre Ca2+- und zyklisches Adenosin-5′-Monophosphat (cAMP)-Signale induziert (23). Die Transkription von Pgc-1α kann durch CaMK, Calcineurin, β-adrenergen Rezeptor/cAMP und p38MAPK beeinflusst werden (24-26). Darüber hinaus hat die zur MAPK-Familie gehörende p38-MAPK eine Schlüsselfunktion bei der Zellproliferation, Differenzierung, Transformation und Apoptose, da die Aktivierung der Apoptose Pgc-1α über eine direkte Phosphorylierung induzieren kann (27). In der vorliegenden Studie wurden die Expressionsniveaus von Proteinen im Ca2+-Signalweg (pan-Calcineurin A und p-CaMKII/CaMKII) und im p38 MAPK-Signalweg (p-p38MAPK/p38 MAPK und p-Erk1/2) untersucht, um die Auswirkungen von NaN3 auf die intrazelluläre Ca2+-Homöostase und p38 MAPK zu untersuchen. Die Daten zeigten, dass die Proteinkonzentrationen von Pan-Calcineurin A und die p-CaMKII/CaMKII- und p-p38MAPK/p38 MAPK-Verhältnisse in der mit NaN3 behandelten Gruppe erhöht und die p-Erk1/2-Konzentrationen verringert waren, was darauf hindeutet, dass NaN3 die Apoptose von PC12-Zellen in einer von der Dosis abhängigen Weise auslöste, und dass eine solche Aktivierung mit den Ca2+- und p38 MAPK-Wegen verbunden war. Insgesamt bestätigen diese experimentellen Ergebnisse, dass NaN3 die Apoptose von PC12-Zellen durch die Aktivierung der Ca2+- und p38-MAPK-Wege auslösen kann. Soweit wir wissen, hat die vorliegende Studie zum ersten Mal gezeigt, dass NaN3 die Apoptose in PC12-Zellen durch Pgc-1α-assoziierte Signalwege, einschließlich Ca2+/p-CaMKII und p38 MAPK, auslöst.

Zusammengefasst hat die vorliegende Studie gezeigt, dass NaN3 die Apoptose von PC12-Zellen auslösen kann. Um den zugrundeliegenden toxischen Mechanismus der NaN3-Exposition aufzuklären, wurden die Expressionswerte einer Reihe von pro-apoptotischen Proteinen (Bax und Cytochrom c) und anti-apoptotischen Proteinen (Bcl-2, Procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII und Pgc-1α) untersucht. Die Ergebnisse bestätigten, dass pro-apoptotische Proteine über die Aktivierung und Phosphorylierung von CaMKII und p38 MAPK, die die Aktivierung von Pgc-1α und Procaspase-3 in PC12-Zellen stimulierten, pro-apoptotische Wirkungen auf PC12-Zellen ausübten. Die Daten bieten eine Grundlage für nachfolgende Studien, die die Wirkungsmechanismen von NaN3 auf molekularer Ebene untersuchen. Zukünftige Studien könnten die Zugabe von Schutzmitteln, z.B. Mitochondrien-Teilungsinhibitor 1, ein Chinazolinon-Derivat, das ein neu identifizierter Mitochondrien-Teilungsinhibitor ist, vor der NaN3-Behandlung einschließen, um die neuroprotektiven Effekte des Schutzmittels bei der Abschwächung der NaN3-induzierten Apoptose in PC12-Zellen zu untersuchen und zusätzlich den zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären.

Acknowledgements

Nicht anwendbar.

Finanzierung

Die vorliegende Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (grantno. 81571848) und dem Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions finanziell unterstützt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in der vorliegenden Studie verwendeten oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Beiträge der Autoren

YZ und SZ haben die Studie konzipiert und entworfen. YZ, JH, HX, TG und YW sammelten die Daten. YZ, JH und HX analysierten und interpretierten die Daten und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript kritisch überarbeitet und die endgültige Version des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Ethische Genehmigung und Zustimmung zur Teilnahme

Nicht zutreffend.

Zustimmung der Patienten zur Veröffentlichung