Molekulares Klonen ist eine Reihe von Techniken, mit denen rekombinante DNA aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Quelle in ein Replikationsvehikel wie Plasmide oder virale Vektoren eingebracht wird. Beim Klonen werden zahlreiche Kopien eines DNA-Fragments von Interesse, z. B. eines Gens, hergestellt. In diesem Video lernen Sie die verschiedenen Schritte des molekularen Klonierens kennen und erfahren, wie Sie das Verfahren einrichten und wie es angewendet wird.
Mindestens zwei wichtige DNA-Moleküle werden benötigt, bevor das Klonen beginnt. Erstens, und das ist das Wichtigste, brauchen Sie das DNA-Fragment, das Sie klonen wollen, auch bekannt als das Insert. Es kann von einem Prokaryoten, Eukaryoten oder einem ausgestorbenen Organismus stammen oder im Labor künstlich hergestellt werden. Durch molekulares Klonen können wir mehr über die Funktion eines bestimmten Gens erfahren.
Zweitens braucht man einen Vektor. Ein Vektor ist Plasmid-DNA, die in der Molekularbiologie als Werkzeug verwendet wird, um mehr Kopien eines bestimmten Gens herzustellen oder ein Protein zu produzieren. Plasmide sind ein Beispiel für einen Vektor und sind zirkuläre, extrachromosomale DNA, die von Bakterien repliziert wird.
Ein Plasmid hat typischerweise eine multiple Klonierungsstelle oder MCS, dieser Bereich enthält Erkennungsstellen für verschiedene Restriktionsendonukleasen, auch bekannt als Restriktionsenzyme. Verschiedene Inserts können durch eine Technik namens Ligation in das Plasmid eingebaut werden. Der Plasmidvektor enthält auch einen Replikationsursprung, der es ermöglicht, ihn in Bakterien zu replizieren. Darüber hinaus enthält das Plasmid ein Antibiotika-Gen. Wenn Bakterien das Plasmid inkorporieren, überleben sie in Medien, die das Antibiotikum enthalten. Dies ermöglicht die Selektion von Bakterien, die erfolgreich transformiert wurden.
Das Insert und der Vektor werden in einen Wirtszellorganismus geklont, wobei E. coli am häufigsten für das molekulare Klonen verwendet wird. E. coli wächst schnell, ist weithin verfügbar und es werden zahlreiche verschiedene Klonierungsvektoren kommerziell hergestellt. Eukaryoten, wie Hefe, können ebenfalls als Wirtsorganismen für Vektoren verwendet werden.
Der erste Schritt des allgemeinen molekularen Klonierungsverfahrens besteht in der Gewinnung des gewünschten Inserts, das aus DNA oder mRNA eines beliebigen Zelltyps gewonnen werden kann. Der optimale Vektor und sein Wirtsorganismus werden dann auf der Grundlage der Art des Inserts und der beabsichtigten Verwendung ausgewählt. Zur Vervielfältigung des Inserts wird häufig eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet.
Danach werden das Insert und der Verdau durch eine Reihe von Enzymreaktionen zusammengefügt und zur Massenvermehrung in den Wirtsorganismus eingeführt. Replizierte Vektoren werden aus Bakterien gereinigt und nach dem Restriktionsverdau auf einem Gel analysiert. Die vom Gel gereinigten Fragmente werden später zur Sequenzierung geschickt, um zu überprüfen, ob es sich bei der Einfügung um das gewünschte DNA-Fragment handelt.
Lassen Sie uns einen etwas genaueren Blick darauf werfen, wie das molekulare Klonen durchgeführt wird. Bevor Sie mit dem Klonen beginnen, sollten Sie Ihre Klonierungsstrategie planen, bevor Sie einen Klonierungsversuch auf dem Prüfstand unternehmen. Ein beliebiger Plasmidvektor bietet Ihnen beispielsweise eine begrenzte Anzahl von Restriktionsstellen, um das Insert über die multiple Klonierungsstelle einzubauen. Sie müssen Restriktionsstellen wählen, die sich nicht in Ihrem Insert befinden, damit Sie es nicht spalten. Möglicherweise sind Sie gezwungen, ein Fragment mit stumpfem Ende mit einem Fragment zu verbinden, das einen Überhang aufweist. In diesem Fall ist die Verwendung des Klenow-Fragments zum Aufbau einer Ligation mit stumpfem Ende möglicherweise die einzige Möglichkeit, das Insert in den gewünschten Vektor zu bringen. Die Kenntnis der verschiedenen molekularen Klonierungswerkzeuge, die Ihnen zur Verfügung stehen, sowie die Ausarbeitung einer sorgfältigen Strategie, bevor Sie mit dem Klonen beginnen, kann eine enorme Zeitersparnis bedeuten.
Die DNA-Quelle für das molekulare Klonen kann durch einfache Extraktionstechniken aus fast allen Arten von Zellen oder Gewebeproben isoliert werden. Nach der Isolierung kann die PCR zur Vervielfältigung des Inserts verwendet werden.
Nach der Vervielfältigung des Inserts werden sowohl das Insert als auch der Vektor durch Restriktionsenzyme, auch Restriktionsendonukleasen genannt, verdaut.
Nach der Verdauung können das Insert und der Vektor auf ein Gel aufgetragen und durch ein Verfahren namens Gelreinigung gereinigt werden. In Bezug auf den Vektor hilft dieser Schritt, das linearisierte Plasmid vom ungeschnittenen Plasmid zu trennen, das dazu neigt, als hochmolekularer Schmierfleck auf einem Gel zu erscheinen.
Nach der Gelreinigung der Verdauungen wird das Insert mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Ligase an das Plasmid ligiert oder gebunden.
Im Allgemeinen ist es immer eine gute Idee, die Ligationen so anzulegen, dass das Verhältnis von Insert zu Vektor 3 zu 1 beträgt, wodurch sichergestellt wird, dass nur eine kleine Menge des Vektors selbstligiert. Nachdem die Ligation auf Eis gelegt wurde, wird sie von 1 Stunde bis über Nacht bei 14-25 °C bebrütet.
Als nächstes wird die Transformation durchgeführt, um den Plasmidvektor in den Wirt einzuführen, der ihn replizieren wird.
Nach der Transformation werden die Bakterien auf Agarplatten mit Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Da das Plasimid ein Antibiotikaresistenzgen enthält, bilden sich nach erfolgreicher Transformation Bakterienkolonien, wenn sie auf Agarplatten in Gegenwart von Antibiotika wachsen. Einzelne Kolonien können dann von der transformierten Platte entnommen, in flüssige Wachstumsmedien in nummerierten Röhrchen gegeben und zur Expansion in einen Schüttelinkubator gestellt werden. Ein kleines Volumen der Flüssigkultur wird auf eine nummerierte Agarplatte gegeben, während der Rest der Kultur zur Plasmidreinigung weitergeleitet wird. Das Nummerierungsschema, das die Identität der bakteriellen Kolonien angibt, von denen die Plasmide schließlich gereinigt werden, wird während des gesamten Plasmidreinigungsprozesses beibehalten.
Eine Probe des gereinigten Plasmids wird dann mit Restriktionsenzymen geschnitten. Der Verdau wird dann geladen und auf dem Gel ausgeführt, um das Vorhandensein eines Inserts zu überprüfen, was bestätigt, dass die Bakterienkolonie mit einem Plasmid transformiert wurde, das ein Insert enthält, und nicht mit einem selbstligierten Plasmid. Bakterien, die nachweislich mit einem inserthaltigen Plasmid transformiert wurden, werden für die weitere Plasmidreinigung expandiert. Die Sequenzierung wird als letzter Verifizierungsschritt durchgeführt, um zu bestätigen, dass das gewünschte Gen geklont wurde.
Molekulares Klonen kann für eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Wenn beispielsweise eine mRNA-Vorlage durch ein Enzym namens Reverse Transkriptase in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben und dann durch PCR amplifiziert wird, kann mit Hilfe des molekularen Klonens eine cDNA-Bibliothek erstellt werden – eine Bibliothek aller von einem bestimmten Zelltyp exprimierten Gene.
Molekulare Klonierung kann auch eingesetzt werden, um eine Reihe von Genen oder Genclustern aus einem Bakterienstamm zu nehmen und sie in Plasmide umzuwandeln, die in einen anderen Stamm transformiert werden, so dass ein ganzer Biosyntheseweg nachgebildet werden kann, um ein komplexes Molekül zu produzieren.
Durch molekulare Klonierung kann eine Mutantenbibliothek erzeugt werden, indem ein Zielplasmid in einem speziellen Bakterienstamm exprimiert wird, der eine fehleranfällige Polymerase verwendet, wenn er bei bestimmten Temperaturen gezüchtet wird. Die Mutationen können durch Sequenzierung charakterisiert werden. Bakterien, die mit mutierten Genen transformiert wurden, können dann mit verschiedenen Medikamenten oder Chemikalien getestet werden, um festzustellen, bei welchen Bakterienkolonien sich eine Medikamentenresistenz entwickelt hat.
Dank molekularem Klonen können Reportergene in DNA-Plasmide eingebaut werden. Ein gängiges Reportergen ist das grün fluoreszierende Protein (GFP), das bei UV-Licht eine grüne Fluoreszenz aussendet. Ein Reportergen kann auch in ein Alphavirus eingebaut werden, um die Infektion von Moskitos und die Übertragbarkeit in Zellen zu zeigen.
Sie haben soeben JoVEs Video über molekulares Klonen gesehen. Du solltest jetzt verstehen, wie das molekulare Klonen funktioniert und wie die Technik in der Molekularbiologie eingesetzt werden kann. Wie immer, vielen Dank fürs Zuschauen!