Forschungsstudien

In unseren Studien haben wir eine EU-Kulturpflanze, Pisum sativum (Erbse), untersucht. Erbsen sind für eine Vielzahl von Viren anfällig, darunter das Erbsenmosaikvirus, das Virus der frühen Verbräunung der Erbse und eine Reihe von Viren aus der Gruppe der Kartoffelviren (Potyviridae). Innerhalb dieser letzten Gruppe sind das Bean yellow mosaic virus, das Bean common mosaic virus, das Pea mosaic virus und das Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) wichtige Krankheitserreger. Wir haben insbesondere das PSbMV untersucht, für das alle kommerziellen Erbsensorten anfällig sind. Diese Anfälligkeit wird durch die Tatsache verstärkt, dass dieses Virus nicht nur durch seinen Blattlausvektor von Pflanze zu Pflanze, sondern auch vertikal von Generation zu Generation im Saatgut übertragen wird. Diese Eigenschaft hat zu einer ernsthaften Kontamination von Erbsen-Keimplasma-Sammlungen geführt und stellt ein sehr wirksames Mittel dar, um eine frühe und weit verbreitete Infektion von Pflanzen kurz nach der Samenkeimung zu erreichen. Wenn man bedenkt, dass eine Samenübertragungseffizienz von nur 0,1 % zu 10.000 Infektionen nach der Aussaat von 107 Samen pro Hektar führen würde, wird die Bedeutung der Samenübertragung deutlich. Derzeit wird diesem Problem durch eine effiziente Nachernteuntersuchung von Saatgutproben durch Immunodetektion des Virushüllenproteins und die Zurückweisung kontaminierter Saatgutpartien begegnet. Als Alternative und da die Saatgutübertragung bei einer Reihe von Erbsensorten zwischen 0 und 100 % schwankt, haben wir untersucht, ob eine Resistenz gegen die Saatgutübertragung in verbesserte Erbsenlinien eingezüchtet werden könnte. Bei Testkreuzungen und Rückkreuzungen zwischen Linien, die keine Übertragung oder eine Übertragung von 60-80 % aufwiesen, verhielt sich die Resistenz wie ein dominantes Merkmal, obwohl sie in den F2- und BC2-Generationen nicht als Mendelsches Merkmal segregierte. Die quantitative Beschaffenheit des Phänotyps deutet darauf hin, dass die Saatgutübertragung nur schwer als Resistenzmerkmal in ein konventionelles Züchtungsprogramm aufgenommen werden kann.

Natürliche Resistenz gegen PSbMV wurde in Erbsen-Akzessionen aus Nordafrika und Asien identifiziert, obwohl diese rezessiven Gene bisher nicht in kommerzielle Linien eingeführt wurden. Genetische Analysen haben gezeigt, dass diese Gene mit anderen rezessiven Genen mit unterschiedlichen Poty-Virus-Spezifitäten an zwei Stellen des Erbsengenoms geclustert sind. Die Gene sbm-1, sbm-3 und sbm-4, die eine Resistenz gegen die PSbMV-Pathotypen PI, L-l bzw. P4 verleihen, befinden sich auf Chromosom 6, während sbm-2, das ebenfalls eine Resistenz gegen den Pathotyp L-l verleiht, auf Chromosom 2 liegt. Obwohl diese Organisation auf eine lokale Genkonversion und Translokation zwischen den Chromosomen 2 und 6 hindeutet, deuten andere Hinweise darauf hin, dass die beiden Gencluster unterschiedliche Ursprünge und Funktionen haben könnten. Mit Hilfe von rekombinanten Hybridviren, die aus verschiedenen Pathotypen hergestellt wurden, wurde die Avirulenzdeterminante des Virus als das virusgenomgebundene Protein (VPg) für sbm-1 definiert. Eine strukturelle und funktionelle Analyse des sbm-1-Gens ist Gegenstand eines EG-Biotechnologieprojekts mit der Nummer BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv), an dem Forschungsgruppen und die Industrie aus Dänemark, Finnland, Spanien und dem Vereinigten Königreich beteiligt sind.

Die Charakterisierung des sbm-1-Gens ist von besonderem intellektuellen und praktischen Nutzen. Da etwa 20 % aller Virusresistenzgene und etwa 40 % der Gene, die eine Resistenz gegen Potyviren verleihen, rezessiv sind, wird es für eine Vielzahl von Krankheiten wichtig sein zu verstehen, wie sbm-1 funktioniert und was die Spezifität der benachbarten sbm- und anderer Potyvirus-Resistenzgene kontrolliert. Das sbm- Projekt ist jedoch auch mit technischen Herausforderungen verbunden, nicht zuletzt wegen der Größe und Redundanz des Erbsengenoms. Das Erbsengenom umfasst etwa 5 x 109 Basenpaare pro haploidem Genom und ist damit etwa 50 Mal größer als das Genom von Arabidopsis thaliana. Die kartenbasierte Klonierung von Genen in Erbsen ist noch nicht gelungen, und es sind noch keine großen Insertionsbibliotheken verfügbar. Es besteht jedoch das Potenzial, in sbm-1 eine neue Klasse von Resistenzgenen zu identifizieren. Die bisher aus anderen Arten klonierten Resistenzgene lassen sich in zwei Klassen einteilen. Die dominanten Resistenzgene, die gegen bestimmte Viren, Pilze und Bakterien wirken, fallen weitgehend in die „NBS-LRR“-Klasse und vermitteln eine hypersensible Resistenz gegen Infektionen. Das einzige rezessive Gen, das kloniert wurde (mlo), vermittelt eine nicht rassenspezifische Resistenz gegen den Echten Mehltau in Gerste und ist auch mit der Lokalisierung des Erregers in toten Zellen verbunden. Funktionell wirkt Mlo als negativer Regulator der konstitutiven Resistenz. Im Gegensatz dazu ist sbm-1 rassenspezifisch (oder pathotypspezifisch) und wird nicht mit dem Zelltod in Verbindung gebracht. Aus diesen Vergleichen ergeben sich mehrere mögliche Funktionsmechanismen für sbm-1. Erstens können wir Sbm-1 als einen dominanten Anfälligkeitsfaktor betrachten, der zur Unterstützung der Virusreplikation erforderlich ist. Dies würde zu der wahrscheinlichen Beteiligung des VPg an der viralen RNA-Replikation und zu der Beobachtung passen, dass Protoplasten aus resistenten Pflanzen keine nachweisbare Virusreplikation aufweisen. Zweitens könnte Sbm-1 wie Mlo als negativer Regulator der Resistenz wirken, obwohl die Spezifitätsunterschiede zu Mlo Sbm-1 in eine andere Klasse von Resistenzgenen einordnen würden. Drittens könnte sbm-1 ein dominantes, aber dosisabhängiges Allel mit schwacher Resistenz sein. Wir bevorzugen die erste Option als die direkteste und einfachste Interpretation.

Für unsere Komponente im EG-Biotechnologieprojekt haben wir uns entschieden, genetische Ansätze zur Identifizierung des sbm-1-Resistenzgenprodukts zu verwenden. Nach der Identifizierung geeigneter Erbsenlinien (ein BC4-Linienpaar, das homozygote Resistenz- und Anfälligkeitsallele trägt) wurde eine cDNA-AFLP-Strategie angewandt, um exprimierte Gene aus der introgressierten Region zu identifizieren. Bislang wurden zehn polymorphe cDNAs identifiziert. Diese werden derzeit mit Hilfe rekombinanter Inzuchtfamilien kartiert, um ihren genomischen Ursprung zu bestätigen. Unsere alternative Strategie besteht darin, nach dem sbm-1-Genprodukt zu „fischen“, indem wir das Hefe-Zwei-Hybrid-System mit dem PSbMV VPg als Köderprotein verwenden. Zwei starke cDNA-Kandidaten und acht weitere cDNAs, die für Interaktorproteine kodieren, wurden aus einer cDNA-Bibliothek von Erbsen identifiziert, die aus einer anfälligen Erbsenlinie gewonnen wurde. Diese cDNAs werden ebenfalls sequenziert und kartiert.

Im Rahmen eines früheren EC-AIR-Projekts (# CT94-1171), an dem akademische und industrielle Partner in Dänemark, Frankreich und dem Vereinigten Königreich beteiligt waren, haben wir auch das Potenzial für die Entwicklung von PDR gegen PSbMV in transgenen Erbsen untersucht. Da in anderen Systemen das Gen der viralen Replikase üblicherweise verwendet wurde, um PDR durch Auslösen des Prozesses des post-transkriptionalen Gen-Silencing (PTGS) zu erzeugen, haben wir das PSbMV-Replikase-Cistron (NIb) für die transgene Expression in Erbsen verwendet. Von 35 Erbsenlinien, die mit T-DNA von Agrobacterium tumefaciens transformiert wurden und ein 35S-Promotor-Nib-35S-Terminator-Konstrukt sowie das bar-Gen als selektierbaren Marker für transformiertes Gewebe in Gegenwart des Herbizids Bialophos tragen, erwiesen sich drei Linien als resistent gegen PSbMV. Zwei dieser Linien trugen eine direkte Wiederholung des 3′-Endes des Nib-Gens (NIbIb), da es Hinweise darauf gab, dass komplexe Transgenanordnungen ein größeres Potenzial zur Auslösung von PTGS haben. Alle diese Linien wiesen eine Art von PDR auf, die als „Recovery“ bezeichnet wird, bei der die Inokulation mit einer Herausforderung zu einer anfänglichen Infektion führt, die Pflanzen sich jedoch schnell erholen und keine weiteren Symptome oder Virusakkumulation mehr zeigen. Die erholten Gewebe sind dann resistent gegen eine weitere Infektion mit dem homologen oder eng verwandten Virusisolat. Um die Bedeutung dieses Phänomens in der Praxis zu beurteilen, wo die Pflanzen mit einer Population verwandter Viren konfrontiert werden können, wurde die Fähigkeit verschiedener PSbMV-Isolate untersucht, PTGS auszulösen und von induzierter PTGS erfasst zu werden. Dabei zeigte sich, dass Viren mit ca. 89 % oder mehr Identität im NIb-Cistron die Resistenz auslösen können, obwohl die Anforderungen an die Spezifität für ein zweites Virus, das als Ziel angesehen wird, höher sein könnten. Zum Vergleich: Die beiden am weitesten voneinander entfernten sequenzierten PSbMV-Isolate unterscheiden sich in der Nib-Region um 89 %. Dieser Unterschied in den Spezifitätsanforderungen für die Auslösung und das Targeting bei PTGS ist ein wichtiger Faktor für die Anwendung der Technologie auf kommerzielle Kulturen. Die relativ breite Resistenz gegen PSbMV-Isolate in transgenen Nib-Erbsen steht im Gegensatz zur extremen Pathotypenspezifität der natürlichen sbm-Resistenzgene, bei denen nur eine oder wenige Veränderungen in der Avirulenzdeterminante des Virus ausreichen, um ein PSbMV-Isolat von avirulent zu virulent zu machen.

Trotz der kurzen Zeitspanne der Erstinfektion zeigten die transgenen Erbsenpflanzen nach der Inokulation ein gutes Wachstum und einen guten Samenansatz und lieferten unter Gewächshausbedingungen Erträge, die denen von nicht infizierten transgenen oder nicht-transgenen Linien entsprachen. Wir glauben, dass diese Pflanzen – vorbehaltlich von Lizenzvereinbarungen über die Verwendung des Bar-Gens für die Selektion transformierter Pflanzen – nützliche Ergänzungen für das Panel der Pathogenresistenzgene sein könnten, die bei der Entwicklung neuer verbesserter Erbsenlinien verwendet werden sollen.

Die transgenen Erbsenpflanzen sind die ersten Leguminosen, die PDR gegen Potyviren aufweisen, und einige der ersten experimentellen Beispiele für Pflanzen, die PTGS zeigen, bei den Leguminosae. Daher war es wichtig festzustellen, dass die Prinzipien, die PTGS und Resistenz in diesem System bestimmen, mit denen übereinstimmen, die bei häufiger verwendeten Versuchspflanzen (z. B. Nicotiana spp.) beschrieben wurden. Wie für PTGS erwartet, war die induzierte Virusresistenz mit dem Abbau von Transgen-RNA und PSbMV-RNA verbunden. Wir haben auch gezeigt, dass PTGS in diesen Pflanzen durch ein systemisches Signal vermittelt wird, das in der Anfangsphase der Virusinfektion erzeugt wird, und dass dieses Signal das Potenzial hat, die Ausbreitung von PTGS zu vermitteln, indem es die Methylierung in der transkribierten Region des NIb-Transgens induziert.

Zusammenfassend haben wir erkannt, dass die Agrarindustrie von einer stabilen und wirksamen Resistenz gegen PSbMV in Erbsen profitieren würde. Der am wenigsten umstrittene Weg, dies zu erreichen, wäre die Einbringung natürlich vorkommender Resistenzen (entweder gegen die Samenübertragung oder gegen die Virusreplikation) mit Hilfe konventioneller Züchtungsstrategien. Unser relativ geringes Verständnis der genetischen Komplexität der PSbMV-Saatgutübertragung bedeutet, dass dies auf kurze Sicht wahrscheinlich nicht sinnvoll sein wird. Die sbm-Gene sind vielversprechender, obwohl das Fehlen eng miteinander verbundener genetischer Marker und die rezessive Natur der Resistenz einige Schwierigkeiten mit sich bringen. Alternativ haben wir das Potenzial für die Schaffung von Resistenzen durch die Anwendung der transgenen Technologie aufgezeigt, obwohl die Fragen der biologischen Sicherheit und der öffentlichen Akzeptanz geklärt werden müssen. Neben diesen anwendungsbezogenen Überlegungen wurden und werden im Rahmen der Forschung Materialien und Erkenntnisse gewonnen, die Einfluss darauf haben werden, wie ähnliche Ansätze bei anderen Nutzpflanzen eingesetzt werden können. Insbesondere das Verständnis der Wirkungsmechanismen einer neuen Klasse von Virusresistenzgenen wird wichtig sein.