Discussion

Die vorliegende Studie identifizierte eine Reihe von unterschiedlichen Merkmalen der kollateralen ECs und SMCs, die den in der Einleitung beschriebenen einzigartigen Eigenschaften der Kollateralen zugrunde liegen oder dazu beitragen können. Wir fanden heraus, dass trotz der niedrigen und oszillierenden Scherspannung, die in den Kollateralen zu Beginn der Studie bei fehlender Obstruktion auftritt, die ECs der Kollateralen in gleichem Maße mit der Gefäßachse ausgerichtet sind wie in den distalsten Arteriolen und der absteigenden Aorta – Gefäße mit orthograder laminarer Strömung mit hoher Geschwindigkeit. Die Endothelzellen sowohl der Kollateralen als auch der Arteriolen haben primäre Zilien, wobei die Kollateralen weniger Zilien aufweisen. Die glatten Muskelzellen der Kollateralen sind im Gegensatz zu denen der DMAs kontinuierlich. In den Kollateralen werden mehr Gene exprimiert, die mit entzündungsfördernden und entzündungshemmenden sowie proliferationsfördernden und proliferationshemmenden Stoffwechselwegen in Verbindung gebracht werden, als in den DMAs. Die Beobachtung, dass die Kollateralen schon kurz nach ihrer Bildung im Embryo eine Tortuosität aufweisen, die bis zum mittleren Alter (16 Monate, 49 menschliche Jahre) zunimmt, spricht für eine höhere Zellproliferation in den kollateralen Muralzellen. Die oben genannten Erkenntnisse geben Einblicke in strukturelle und molekulare Spezialisierungen, die den einzigartigen Merkmalen und Funktionen von Kollateralgefäßen zugrunde liegen können.

Die Konvergenz des Blutflusses in den Kollateralen zu Beginn übt geringe und „gestörte“ Fluss-/Schubspannungskräfte auf ihre Wandzellen aus, d. h. entweder kein Fluss oder ein sehr geringer Fluss, der hin und her oszilliert (~1-10 Mal pro Minute) und im Durchschnitt Null beträgt. Dies führt zu einer erhöhten Wandspannung gemäß der Bernoulli-Beziehung. An anderen Stellen des arteriellen Kreislaufs, z. B. an Bifurkationen, dem Innenbogen der Aorta oder stromabwärts von Plaques, begünstigen niedrige und gestörte Schubspannungen eine nicht ausgerichtete, kopfsteinpflasterartige EC-Morphologie, die mit erhöhtem oxidativem Stress, Entzündungen, Alterungsmarkern und geringer eNOS/NO-Aktivität (d. h. endothelialer Dysfunktion) einhergeht. Überraschenderweise stellten wir jedoch fest, dass kollaterale ECs die gleiche Ausrichtung (und Zellgröße) aufweisen wie ECs in DMAs und der absteigenden Aorta. Wir haben nicht untersucht, wie dieser entzündungshemmende strukturelle Phänotyp zustande kommt. Es ist möglich, dass eines oder mehrere der anderen einzigartigen Merkmale, die wir identifiziert haben, daran beteiligt sind (siehe unten). Andererseits wurden die Daten in Abbildung 2 für Fluss und Scherspannung bei betäubten Tieren gewonnen. Im Wachzustand können Kollateralen Perioden anhaltenden Flusses in die eine oder andere Richtung aufweisen, die durch Veränderungen der regionalen Stoffwechselaktivität in dem Gebiet verursacht werden, das von den Arterienbäumen versorgt wird, die sie kreuzen. Es ist nicht bekannt, ob die Kollateralen auf diese Weise zur physiologischen metabolischen Regulierung des Blutflusses und der Sauerstoffzufuhr beitragen, d. h. zur neurovaskulären Kopplung im Gehirn und zur funktionellen Hyperämie anderswo. Solche Perioden anhaltender unidirektionaler Strömung könnten jedoch die von uns beobachtete EC-Orientierung fördern. Unabhängig von der zugrundeliegenden Ursache spekulieren wir, dass der ausgerichtete Phänotyp der kollateralen ECs Teil (oder ein Marker) einer Gruppe von Schutzmechanismen ist, die die Aufrechterhaltung der Kollateralen begünstigen und ihre Rarefaktion abmildern (Abbildung 9).

Unseres Wissens ist dies der erste Bericht, der zeigt, dass ECs, die Kollateralen und Arteriolen auskleiden, primäre Zilien haben. Sie sind viel häufiger als bisher für Conduit-Gefäße gesunder Personen berichtet (d. h. sie fehlen oder sind auf weniger als 1 % der ECs vorhanden): 18 % der ECs in den Kollateralen haben PrC, verglichen mit 28 % bei DMAs. Primäre Flimmerhärchen auf ECs wurden 1984 von Haust in der Aorta von Kaninchen und Menschen mit Atherosklerose beschrieben. In späteren Berichten wurden ECs mit Flimmerhärchen in Kapillaren der Zirbeldrüse eines 20 Wochen alten menschlichen Fötus, in sich entwickelnden Herz- und Aortenklappenblättchen (und Verweise darin), in der Umgebung von Atheromen, ektopisch in der Arteria carotis communis von ApoE-/- Mäusen und bei gesunden Menschen an Bifurkationen von Conduit-Arterien und in der Innenkrümmung des Aortenbogens beschrieben; im Gegensatz dazu fehlen Flimmerhärchen in Regionen von Arterien, in denen die Scherbelastung laminar ist, oder sie sind fast nicht vorhanden. Die meisten anderen Zelltypen exprimieren PrC während der Entwicklung, unter bestimmten Bedingungen in der Zellkultur und im Erwachsenenalter. Je nach Zelltyp sind PrC an der Spezifizierung der Asymmetrie des Embryos, der Zentriolenanordnung, der Proliferation/Zellzyklusregulation, der Autophagie, der strömungsabhängigen Mechanotransduktion, der Chemozeption sowie der Kompartimentierung und dem Transport von Signalproteinen zwischen dem Ziloplasma, dem Zytoplasma und dem Nukleoplasma (z. B. für Gli und PDGFRα) beteiligt. Wenn Zilien vorhanden sind, sind sie am häufigsten in nicht proliferierenden Zellen zu finden, wobei das proximale Ende in einer Einstülpung des Plasmalemmas (Ziliartasche) in ECs und anderen, aber nicht allen Zelltypen verankert ist. Primäre Zilien sind mit der Mutterzentriole des Basalkörpers verbunden, die mit dem Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) verknüpft ist. Die Demontage/Resorption des Ciliums während der S-Phase und die Freisetzung der Zentriole sind für die Zellteilung unerlässlich. Da die PrC über das MTOC mit dem Zytoskelett verbunden sind, kann die strömungsinduzierte Biegung der Zilien in der gesamten Zelle, auch an den Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen, übertragen werden. Primäre Zilien leiten Flüssigkeitsschubspannungen in Nierentubulusepithelzellen und ECs über einen Weg weiter, der besonders empfindlich auf Schubspannungen reagiert und an dem Polycystin-1 und Polycystin-2 beteiligt sind, die von Pkd1 und Pkd2 kodiert werden. Polycystin-1 hat mechanosensitive Eigenschaften, während Polycystin-2 ein TRP-Kalziumkanal ist. Beide Proteine sind erforderlich, um Scherstress zu erkennen und wiederum Stickstoffmonoxid freizusetzen. Defekte in PrC werden mit vielen Anomalien in Verbindung gebracht. Beispielsweise sind Mutationen von PKD1 und PKD2 ursächlich für die autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung, bei der ECs und tubuläre Zellen der Niere von Patienten eine mangelhafte Kalzium- und NO-Reaktion und eine erhöhte Proliferation aufweisen.

Primäre Zilien fehlen in ECs aus menschlichen Nabelvenen, die unter laminarem Scherstress und proliferativer Ruhe in Zellkultur gehalten werden. In menschlichen Nabelvenen haben weniger als ein Prozent der ECs Zilien, die in das Lumen hineinragen, während bei einem größeren Anteil die Zilien intrazellulär angeordnet sind. Embryonale Aorta und daraus gezüchtete ECs haben ein einziges Cilium, das in das Lumen ragt. Endothelzilien sind in Regionen mit hoher Scherbelastung während der Embryonalentwicklung vorhanden, zusammen mit der Expression des scherbelastungsempfindlichen Transkriptionsfaktors KLF2, der eNOS und andere entzündungshemmende und antiproliferative Gene transaktiviert. In Regionen mit geringem oder gestörtem Scherstress werden PrC abgebaut/abwesend und die Expression von Klf2 und eNOS ist aufgehoben bzw. reduziert. Die Expression von Klf2 wird auch in nicht bewimperten ECs gehemmt, die aus embryonalen Arterien isoliert wurden, und die chemische Entfernung von PrC aus ECs in Kultur hat einen ähnlichen Effekt, nämlich die Aufhebung der Klf2-Expression. Interessanterweise werden in ECs von erwachsenen ApoE-/- Mäusen, die eine endotheliale Dysfunktion aufweisen, aber keine Plaques entwickeln, Zilien in der gemeinsamen Karotisarterie ektopisch exprimiert, obwohl ein laminarer Fluss vorhanden ist, verglichen mit Wildtyp-Mäusen, die keine Zilien aufweisen. Die Zilien gingen verloren, wenn durch die Implantation einer strömungsbeschränkenden Gussform um das Gefäß ein hoher Scherstress ausgelöst wurde. Bei Wildtyp-Mäusen wurde die Zilienbildung nur in Regionen mit niedrigem und gestörtem Scherstress induziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression von PrC auf ECs in vivo bei Erwachsenen auf Regionen mit geringer/gestörter Scherbelastung beschränkt ist, aber ektopisch in Arterien mit laminarem Fluss auftreten kann, wenn eine endotheliale Dysfunktion vorliegt, die durch Hyperlipidämie und möglicherweise andere vaskuläre Risikofaktoren verursacht wird. Bemerkenswert ist, dass in stark bewimperten Bereichen mit gestörter Strömung, wie z. B. der Innenkrümmung des Aortenbogens oder stromabwärts von Plaques, etwa 25 % der ECs ein einzelnes Cilium aufweisen, während der Rest nicht vorhanden ist, ein Prozentsatz, der dem entspricht, den wir in Arteriolen und Kollateralen beobachtet haben.

Unsere Erkenntnisse, dass PrC auch auf Arteriolen und Kollateralen in gesunden jungen erwachsenen Mäusen vorhanden sind, unterstreichen die Notwendigkeit von Studien zur Untersuchung der Zilienfunktion in diesen Gefäßtypen. Dazu gehört auch die Feststellung, ob unsere Beobachtung, dass auf kollateralen ECs weniger Zilien vorhanden sind als auf Arteriolen, eine funktionelle Bedeutung hat. Endothelzellen sind mechanisch, elektrisch und diffusionell mit benachbarten ECs und SMCs gekoppelt, so dass möglicherweise nur ein Bruchteil der ECs Zilien für die Weiterleitung mechano-sensitiver oder anderer Signale exprimieren muss. Hoher Scherstress führt zum Abbau der Zilien in kultivierten ECs, während eine oszillierende Strömungsumkehr ihre Expression anregt. Wir vermuten, dass die Zilien auf arteriellen und kollateralen ECs die geringere Strömung/Schubspannung in Arteriolen und die sehr geringe und gestörte Strömung in Kollateralen widerspiegeln und dass weniger PrC auf kollateralen ECs dazu dienen, ihre Empfindlichkeit gegenüber der vorherrschenden gestörten Schubspannung zu verringern. Mit anderen Worten, weniger Zilien auf kollateralen ECs könnten Teil eines Repertoires von Anpassungen sein, die – durch eine aufrechterhaltene oder verstärkte Expression von KLF2/4, eNOS und anderen entzündungshemmenden/antiproliferativen Faktoren – den niedriggradigen entzündlichen, oxidativen, proliferativen und apoptotischen Signalen entgegenwirken, die durch das gestörte hämodynamische Umfeld in den Kollateralen gefördert werden (Abbildung 9). Egorova et al. schlugen etwas Ähnliches vor, nämlich dass, da das Vorhandensein von PrC auf ECs mit der KLF2-Expression assoziiert ist, endotheliale Zilien eine Bremse für die EC-Aktivierung in Regionen mit niedrigem und gestörtem Fluss darstellen könnten. Eine schützende Rolle der Zilien in diesen Regionen wird durch den jüngsten Bericht gestützt, dass die Entfernung der endothelialen Zilien durch konditionale Deletion von Ift88 die Atherosklerose und die Expression von Entzündungsgenen erhöht und die eNOS-Aktivität in Apoe-/- Mäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden, verringert, und dass das Endothel in atheroanfälligen Regionen sensibilisiert wird, um eine osteogene Differenzierung in Tg737 (orpk/orpk) Mäusen mit Ziliendefekt zu erfahren. Es ist auch möglich, dass, wenn PrC schützend wirken, eine geringere Anzahl von ihnen in den Kollateralen zu der hohen Anfälligkeit dieser Gefäße für eine altersbedingte Rarefaktion und andere vaskuläre Risikofaktoren beitragen könnte. Eine geringere Anzahl von Zilien in den Kollateralen könnte jedoch auch einfach eine sekundäre oder zufällige Wirkung widerspiegeln, z. B. die Folge einer höheren inhärenten Proliferationsrate der kollateralen ECs, wie sie sich in der progressiven Zunahme der kollateralen Tortuosität (siehe unten) zeigt, da das Vorhandensein von PrC und ihre Assoziation mit dem Basalkörper vermutlich die Entfernung von Zellen aus dem Zellzyklus begünstigt. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um festzustellen, ob unser Befund multipler Zilien auf ECs ECs widerspiegelt, die eine proliferative Seneszenz und damit verbundene fehlgeschlagene Zytokinese und Kernpolyploidie durchlaufen haben .

Kürzlich wurde gezeigt, dass ECs in der sich entwickelnden Mäusenetzhaut auf PrC angewiesen sind, um Gefäßverbindungen während des Umbaus des Gefäßplexus in Regionen mit geringer bis mittlerer Scherbelastung zu stabilisieren. Endotheliale Zilien nehmen in Zebrafischembryonen die Strömung wahr, sind an der Rekrutierung von Muralzellen in arteriellen Gefäßen beteiligt und für eine normale Gefäßmorphogenese erforderlich. Die Anzahl und der Durchmesser der Kollateralen nehmen ab dem mittleren Lebensalter ab. Diese altersbedingte Seltenheit wird durch einen genetischen oder pharmakologisch induzierten eNOS/NO-Mangel oder das Vorhandensein von vaskulären Risikofaktoren stark beschleunigt. Erhöhter Scherstress induziert den kollateralen Umbau nach außen nach einer akuten oder sich langsam entwickelnden arteriellen Obstruktion. Pkd1+/- Mäuse und Patienten mit autosomal dominanter polyzystischer Nierenerkrankung haben eine endotheliale eNOS/NO-Dysfunktion. Es wird wichtig sein, in zukünftigen Studien zu untersuchen, ob kollaterale PrC an einer oder mehreren der oben genannten Funktionen beteiligt sind, indem EC-spezifisches Knockdown von Polycystin-1 verwendet wird, da: 1) ein Mangel an Polycystin-1 zu einer veränderten Ziliarfunktion führt, 2) Polycystin-1 zusammen mit Polycystin-2 am Flow-Sensing durch PrC beteiligt ist, 3) mutierte Formen beider Proteine eine polyzystische Nierenerkrankung verursachen, 4) es Hinweise darauf gibt, dass VHL, unabhängig von seiner Rolle beim Abbau von Hif1α, unabhängig von seiner Rolle beim Abbau von Hif1α, zusammen mit GSK3β für die strukturelle Aufrechterhaltung des Ciliums erforderlich ist, und 5) das Protein Rabep2, das für die Kollaterogenese erforderlich ist, ein neuartiges Substrat von GSK3β ist, am Cilium-Grundkörper-Komplex lokalisiert ist und dessen Ausschaltung zu einer defekten Ciliogenese führt. Andere Ansätze zur Beeinflussung des Vorhandenseins und der Funktion von Zilien, z. B. durch Knockdown anderer Zilienproteine wie Pkd2 und Ift88, müssen ebenfalls untersucht werden.

Im Gegensatz zu den distalen Arteriolen, die in verschiedenen Geweben, einschließlich der Netzhaut, spärliche und diskontinuierliche SMCs aufweisen (wir konnten keine Studien im Gehirn finden), waren die SMCs in den Kollateralen kontinuierlich. Wir vermuten, dass es sich hierbei um eine adaptive Zunahme der Wanddicke handelt, um die Zunahme der Wandspannung in Umfangsrichtung auszugleichen, die durch die von Bernoulli beschriebene Umwandlung der kinetischen Energie des Flusses in erhöhte potentielle Energie (transmuraler Druck) als Folge der Flusskonvergenz in den Kollateralen verursacht wird. Es wäre interessant zu untersuchen, ob die Zusammensetzung und Menge der extrazellulären Matrix, die die SMCs beim Ausgleich der erhöhten Wandspannung in Kollateralen unterstützen könnte, in Kollateralen und Arteriolen unterschiedlich ist. Bemerkenswert ist, dass Kollateralen trotz ihrer erhöhten SMC-Bedeckung im Vergleich zu Arteriolen ähnlicher Größe eher einen geringeren als einen höheren Tonus aufweisen und keine myogene Reaktionsfähigkeit besitzen – zusätzliche einzigartige Merkmale von Kollateralgefäßen.

Die gestörte hämodynamische, pro-oxidative Umgebung, in der sich kollaterale Muralzellen befinden, veranlasste uns zu untersuchen, ob sich die Expression von Genen, die an Entzündung, Zellproliferation, Alterung und Angiogenese beteiligt sind, bei Kollateralen und distalen Arteriolen unterscheidet. Die Kollateralen wiesen erhöhte mRNA-Werte für das pro-inflammatorische, pro-apoptotische Inflammasom-Gen Pycard, die pro-proliferativen Gene Ki67, Pdgfb und Angpt2, das anti-proliferative Gen Dll4 und das Gen Ephrinb2 auf, das die Differenzierung der arteriellen EC markiert. Die Expression der Zellzyklus-Inhibitor-Gene p21, p27 und p53 unterschied sich jedoch nicht, ebenso wenig wie die anderer Gene, die mit Proliferation, Zellzyklus-Stillstand und Alterung in Zusammenhang stehen (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, Telomerase). Ebenso wenig gab es Unterschiede in der Expression anderer Gene, die mit der EC- und/oder SMC-Proliferation in Verbindung gebracht werden (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) und die (im Falle der ersten drei Gene) für die Bildung von Kollateralen während der Entwicklung erforderlich sind oder die an der Spezifikation der EC- und SMC-Differenzierung und der Ruhephase beteiligt sind (Tgfb, Angpt1). Die erhöhte Expression der oben genannten proliferationsfördernden Gene in den Kollateralen steht im Einklang mit unseren Tortuositätsmessungen, die darauf hindeuten, dass die kollateralen Muralzellen eine höhere Proliferationsrate aufweisen als andere arterielle Gefäße: Die kollaterale Tortuosität war bereits am ersten Tag nach der Geburt erkennbar, nahm bis zum mittleren Lebensalter weiter zu und ging dann zurück. Letzteres geschah zur gleichen Zeit wie die Abnahme der Anzahl und des Durchmessers der Kollateralen bei fortgeschrittenem Alter. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass die altersbedingte Kollateralverdünnung durch proliferative Seneszenz und anschließende Apoptose der kollateralen ECs und SMCs aufgrund einer lebenslang erhöhten Proliferationsrate verursacht wird, die durch die gestörte hämodynamische und sauerstoffarme Umgebung, in der sich die Kollateralen befinden, bedingt ist (Abbildung 9).

Kollateralen zeigten auch eine erhöhte Aktivität von eNOS, die früheren Studien zufolge der durch Alterung und andere vaskuläre Risikofaktoren verursachten Verdünnung der Kollateralen entgegenwirkt. eNOS-abgeleitetes NO hemmt oxidativen Stress, Entzündung, Proliferation, Leukozytenadhäsion, Thrombozytenaggregation und Zellalterung und fördert die SMC-Relaxation. Da Scherstress ein unmittelbarer Stimulus für das von der eNOS abgeleitete NO ist, kann eine erhöhte eNOS/NO in den Kollateralen mit ihrer niedrigen und gestörten Scherstressumgebung die Wirkung von Faktoren abschwächen, die die kollaterale Rarefaktion fördern (Abbildung 9). Ebenso kann die aufrechterhaltene Expression der scherstressempfindlichen Transkriptionsfaktoren Klf2 und Klf4 in Kollateralen trotz des niedrigen und oszillierenden Flusses, der die Expression dieser Faktoren an anderen Stellen des arteriellen Gefäßsystems mit gestörtem Fluss hemmt, als zusätzliche „ausgleichende“ Faktoren oder kollaterale Spezialisierungen wirken, zusammen mit erhöhter eNOS, ausgerichteten ECs, weniger Zilien, robuster SMC-Bedeckung und erhöhtem Ephrin-B2 und Dll4. Die Expression von KLF2 und KLF4, die Proliferation, Entzündung und Angiogenese negativ regulieren, eNOS hochregulieren und an Stellen mit niedriger und gestörter Scherbelastung stark herunterreguliert werden, unterschied sich in Kollateralen nicht von DMAs. Interessanterweise fördern PrC die Expression von Klf2, Klf4 und eNOS.

Eine Einschränkung der oben genannten Studien besteht darin, dass die RNA aus sezierten Gefäßen gewonnen wurde, die aus ECs, SMCs und, wenn auch in geringerem Maße, Perizyten, Fibroblasten und ansässigen myeloischen Zellen bestehen. Es sind Studien erforderlich, die eine Trennung der Zelltypen und die Untersuchung einer breiteren Palette von Genen und ihrer jeweiligen Proteingehalte vorsehen. Die Schwierigkeit, Kollateralen und distale Arteriolen in der erforderlichen Anzahl manuell zu sezieren, die Auswirkung von Zelldissoziationstechniken auf die Ausgangswerte von RNA und Proteinen, das Fehlen von Zellkulturmodellen „kollateraler“ ECs und SMCs und das bisherige Fehlen eines kollateralspezifischen Markergens schließen jedoch die Anwendung dieser Ansätze aus. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Expression mehrerer der untersuchten Gene spezifisch oder angereichert für ECs ist, z. B. Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 und Klf4. Die Analyse der Gentranskription spiegelt jedoch nicht immer Veränderungen im Proteinniveau oder in der Funktion wider; daher kann die Untersuchung von Markern für oxidativen Stress, Entzündungen, Proliferation oder Seneszenz auf Proteinebene Unterschiede in den zellulären Eigenschaften besser widerspiegeln.