Aristoteles opetti Aleksanteria (356-323 eaa.) ennen kuin ruhtinas peri Makedonian valtaistuimen vuonna 336 eaa. ja alkoi laajentaa valtakuntaa, jonka hänen isänsä oli voittanut valloituksilla. Myöhemmin Ateenan lyseon puutarhaan tuli kasveja, jotka Aleksanterin armeijan seuraajat olivat tuoneet sinne. Theofrastos perusti monet kasvikuvauksensa kertomuksiin, jotka hän sai matkamiehiltä, jotka olivat vierailleet Aleksanterin valtakunnan kaukaisilla alueilla. Aleksandrian kirjasto, jota Dioskorides todennäköisesti käytti, avattiin Aleksanterin kenraalin Ptolemaios I Soterin (n. 367 eaa. – n. 283 eaa.) valtakaudella. Ptolemaios I oli Aleksanterin läheinen henkilökohtainen ystävä ja saattoi olla Aristoteleen opettama oppilastoveri. Hänestä tuli Egyptin hallitsija vuonna 323 eaa. Aleksanterin kuoleman jälkeen. Varsinainen kirjaston suunnittelu- ja valvontatyö annettiin Demetrios Phaleronille (n. 350- n. 280 eaa.), joka oli Theofrastoksen Lykeumin oppilas.

Aleksanteri hallitsi Makedoniaa regenttinä vuodesta 340 eaa. alkaen, kun hänen isänsä Filippos II johti suurta makedonialaista armeijaa, joka tunkeutui Traakiaan, Makedoniaan idässä rajoittuvaan maahan. Myöhemmin Aleksanteri riitaantui Filippoksen kanssa ja jätti Makedonian, mutta vuonna 336 eaa. Filippos salamurhattiin, ja 20-vuotiaasta Aleksanterista tuli Makedonian Aleksanteri III, jota myöhemmin kutsuttiin Aleksanteri Suureksi. Kun uutinen Filippoksen kuolemasta levisi, makedonialaisten valloittamissa maissa asuvat ihmiset näkivät mahdollisuuden vallata vapautensa, ja Aleksanterin oli toimittava. Hän aloitti teloittamalla kaikki vastustajansa Makedonian sisällä ja palautti sitten Makedonian vallan Kreikassa, Traakiassa ja Illyriassa.

Jättämällä kokeneen kenraalin Antipaterin (n. 398-319 eaa.) pitämään yllä järjestystä kotimaassaan Aleksanteri johti vuonna 334 eaa. suuret joukot Vähä-Aasiaan keisarillisen laajentumisensa ensimmäisenä vaiheena. Makedonialaiset kukistivat suuren persialaisen armeijan, varmistivat Vähä-Aasian rannikon, ja vuonna 333 eaa. he taistelivat ja kukistivat toisen persialaisen armeijan, jota johti Persian kuningas Dareios III. Tämän jälkeen Aleksanterin joukot taistelivat etelään Syyrian ja Foinikian läpi. Keväällä 331 eaa. makedonialaiset tunkeutuivat Egyptiin. Muutaman kuukauden kuluttua he palasivat Tyyroon, jossa he saivat vahvistuksia Euroopasta ja suuntasivat itään. He kukistivat persialaiset vielä kerran Gaugemalassa, Tigrisjoen itäpuolella, valtasivat Babylonin ja valtasivat sitten Susan ja Persian pääkaupungin Persepolin, ja Aleksanteri julistettiin Aasian kuninkaaksi. Tämän jälkeen makedonialaiset jatkoivat Dareioksen jahtaamista, jonka he löysivät kuolemaisillaan erään oman aatelismiehensä aiheuttamista haavoista – makedonialaiset ottivat hänet myöhemmin kiinni ja rankaisivat häntä Aleksanterin käskystä. He jatkoivat matkaansa itään Keski-Aasiaan ja saapuivat Länsi-Kiinassa sijaitseville Tian Shan -vuorille, jonka hautapaikalta on löydetty kreikkalaisen sotilaan patsas.

Vuonna 326 eaa. Aleksanteri kutsui nykyisen Pohjois-Pakistanin alueelta kotoisin olevia päälliköitä alistumaan valtaansa. Osa suostui, mutta osa vastusti makedonialaisia ja voitti vasta kiivaiden taistelujen jälkeen, joissa Aleksanteri haavoittui. Makedonialaiset sotilaat, jotka kaipasivat nähdä kotinsa ja perheensä, vastustivat Aleksanterin suunnitelmaa tunkeutua kauemmas Intiaan ja taivuttelivat hänet kääntymään takaisin. He saapuivat Babyloniaan, jossa Aleksanteri kuoli 11. kesäkuuta 323 eaa. Nebukadnessar II:n palatsissa. Historioitsijat ovat epävarmoja hänen kuolemansa syystä, mutta todennäköisimmin se johtui sairaudesta. Vielä kuukauden kuluttua Aleksanteri olisi täyttänyt 33 vuotta. Kuten seuraavasta kartasta käy ilmi, hänen valtakuntansa ulottui huipullaan Makedoniasta lännessä Induksen laaksoon idässä ja Mustanmeren ja Kaspianmeren etelärannalta Egyptiin. Valtakunta alkoi hajota muutamassa vuodessa Aleksanterin kuoleman jälkeen hajoten moniin itsenäisiin valtakuntiin.

Aleksanteri oli ollut Aristoteleen oppilas, ja vaikka nuoren miehen koulutus oli keskeytynyt, hän oli erittäin älykäs, ja Aristoteles oli vaikuttanut voimakkaasti hänen kehitykseensä. Aristoteles kannusti kaikkia oppilaitaan havainnoimaan ja tutkimaan luontoa, ja Aleksanteri oli innokkaasti kiinnostunut kasveista ja eläimistä. Suuri joukko oppineita seurasi häntä, kun hän johti armeijoitaan. He mittasivat etäisyyksiä, laativat karttoja, tutkivat vieraita uskontoja sekä kasvistoa ja eläimistöä. Kun he törmäsivät tuntemattomiin kasvi- tai eläinlajeihin, Aleksanteri lähetti näytteitä takaisin Eurooppaan, monet niistä Ateenan lyseoon, jossa Aristoteles itse kiinnitti niihin huomiota. Hän keräsi kaiken mahdollisen tiedon paikallisista kasvirohdosvalmisteista ja harjoitti lääketiedettä ja hoiti henkilökohtaisesti joitakin sotilaitaan vaivanneista vammoista ja sairauksista.

Aleksanteri perusti Aleksanteri vuonna 332 eaa. Aleksanteri perusti Aleksandrian kaupungin egyptiläisen kalastussataman Rhakotisin paikalle. Hänen tarkoituksenaan oli, että kaupunki yhdistäisi Kreikan ja Egyptin kulttuurit, mutta hän jäi sinne vain muutamaksi kuukaudeksi rakentamisen aloittamisen jälkeen, eikä koskaan palannut. Aleksanterin kuoleman jälkeen Ptolemaios I onnistui saamaan hänen ruumiinsa tuotua kaupunkiin. Aleksandrian kirjasto rakennettiin Lyceumin kopioksi, jossa oli pylväskäytävä ja puutarhat. Siellä oli luentosaleja, lukuhuoneita ja yhteinen ruokasali, ja kirjasto sijaitsi Musaeumin vieressä ja sen palveluksessa, joka oli akateemisena laitoksena käytetty temppeli – ja josta sana museo on peräisin. Kirjaston johtajat saivat tehtäväkseen kerätä kaiken maailman tiedon. Kirjaston edustajat osallistuivat kirjamessuille Ateenassa ja Rodoksella, ja aina kun laiva saapui satamaan, sen mukanaan kuljettamat kirjat takavarikoitiin ja kopioitiin, ja kirjasto säilytti alkuperäiskappaleet ja palautti kopiot laivanvarustajalle. Tässä kirjastossa Pedanius Dioscorides on saattanut opiskella. Suuri osa kirjastosta poltettiin vahingossa vuonna 48 eaa. sisällissodan aikana, ja vaikka kirjaston tytärkirjastona tunnettu haara jatkoi toimintaansa kaupungin eteläpuolella, sekin tuhoutui vuonna 391 eaa., kun Rooman keisari Theodosius I (347-395) määräsi hävittämään kaikki pakanatemppelit.