2.19.2.3.3 Eluutio-olosuhteet

Tehokkaiden eluutioliuosten tulisi ideaalitilanteessa häiritä analyytin ja vasta-aineen välisiä vuorovaikutussuhteita vaikuttamatta haitallisesti immobilisoituun Abs:ään. Syrjäyttäjä on erittäin konsentroitunut ristireagoiva molekyyli, joka pystyy aiheuttamaan biospesifisen desorption. Siirtymismolekyylit kilpailevat sitoutuneiden analyyttimolekyylien kanssa, ja suuri siirtymismolekyylin ylijäämä takaa analyytin kvantitatiivisen desorption. Optimaalisen suorituskyvyn saavuttamiseksi displacerin on täytettävä useita kriteerejä: (1) suuri ristireaktiivisuus immobilisoitujen vasta-aineiden kanssa, (2) retentioaika, joka poikkeaa merkittävästi analyyttien retentioajasta, koska suuri ylijäämä aiheuttaa näkyvän piikin, joka voi helposti häiritä analyyttien havaitsemista, (3) hyvä stabiilisuus ja korkea puhtaus, koska epäpuhtaudet, joita on vain 0,01-0,1 %, voivat häiritä kromatogrammia, ja (4) edullinen hinta, ei-myrkylliset ominaisuuksiltaan, ei esiintyminen todellisissa näytteissä eikä alhainen detektoitavuus analyytteihin verrattuna. Lisäksi tarvitaan suuri määrä eluointiliuosta, mikä pakottaa konsentroimaan klassisen SPE-tuen ennen analyysia. Näin ollen suositaan eluutio-olosuhteita, jotka mahdollistavat kohdeanalyytin täydellisen talteenoton pienellä eluutiotilavuudella.

Haotrooppisia ioneja käytetään yleisesti suurten molekyylien, kuten proteiinien, eluointiin. Nämä ionit häiritsevät vesirakennetta suurten molekyylien eli vasta-aineiden ja kohdemolekyylien ympärillä, mikä saa aikaan hydrofobisten vuorovaikutusten katkeamisen suurten molekyylien rakenteissa sekä analyytin ja vasta-aineen välillä. Yleisimpiä kaotrooppisia ioneja ovat kloridi-, jodidi-, perkloraatti- ja tiosyanaatti-ionit, joiden pitoisuudet ovat välillä 1,5-8 mol l-1. Erilaiset vesiliuokset, joita voidaan menestyksekkäästi käyttää proteiinien desorptioinnissa IS:stä, osoittautuivat kuitenkin kykenemättömiksi desorboimaan pieniä molekyylejä. Proteiinin desorptio perustuu todennäköisesti pääasiassa sidotun proteiinin rakenteen muutoksiin (osittainen denaturoituminen) eikä immobilisoitujen vasta-aineiden rakenteen muutoksiin. Siksi denaturoitumiselle herkkien pienten molekyylien eluointi edellyttää paljon tiukempia olosuhteita. Lisäksi lämpötilan noustessa 4 °C:sta 43 °C:een vasta-aine-analyytti-vuorovaikutusten dissosiaatiovakio voi kasvaa kahdella suuruusluokalla. Tämä menetelmä ei ole riittävän tehokas, jotta sitä voitaisiin soveltaa pienten molekyylien eluointiin. Eluointi matalan pH:n liuoksilla tehdään usein pienten molekyylien desorboimiseksi IS:stä, mutta tähän tarvitaan kolme pH-yksikköä vasta-aineen isoelektrisestä pisteestä. Tällaisella eluoinnilla (pH:n siirto ilman ionivahvuuden muuttamista) vältetään labiilien vasta-aineiden vahingoittuminen. Yksi haittapuoli on se, että täydelliseen desorptioon tarvitaan edelleen suuria tilavuuksia, mikä vähentää uuttomenetelmiin liittyviä rikastuskertoimia.

Pienten molekyylien tehokas eluointi IS:stä voidaan saavuttaa pienemmällä tilavuudella vesi-orgaanisen modifioijan seosta. Esimerkkinä kuvassa 6 esitetään kahden rikkakasvien torjunta-aineen, isoproturonin ja atratsiinin, eluoitumisprofiili sen jälkeen, kun kummallakin analyytillä terästetty vesinäyte on perkoloida vastaavaan IS:ään. Useita veden kanssa sekoitettuja eluointiliuottimia (metanoli, etanoli ja ACN) arvioitiin.

Kuva 6. Atratsiinin, isoproturonin, 2,4,6-trikloorifenolin ja pentakloorifenolin eluoitumisprofiilit vastaavasta IS:stä käyttämällä eluutioliuoksia, jotka sisältävät kasvavia määriä orgaanista liuotinta happamoituneessa tai happamoittamattomassa vedessä sen jälkeen, kun kullakin analyytillä piikitetyt vesinäytteet oli perkooloitu. ACN, asetonitriili; MeOH, metanoli; EtOH, etanoli; AA, etikkahappo; TFA, trifluorietikkahappo.

Tuloksena saadut eluointiprofiilit riippuvat voimakkaasti liuottimen luonteesta. Kolme testattua liuotinta mahdollistavat molempien analyyttien täydellisen eluoitumisen. ACN:llä on kuitenkin suurin eluution voimakkuus: tämän liuottimen pienin pitoisuus mahdollistaa molempien analyyttien täydellisen eluution. ACN-pitoisuus 40 % ja 60 % riittää isoproturonin ja atratsiinin talteenottoon, kun taas metanolia tarvitaan 60 % ja 80 %. Tässä tapauksessa liuottimen eluointivahvuus näyttää liittyvän sen hydrofobiseen luonteeseen, sillä ACN (Hildebrandin liukoisuusparametri δ = 24,3 MPa1/2) on vähemmän poolinen kuin etanoli (δ = 26,0 MPa1/2) ja metanoli (δ = 29,7 MPa1/2). Nämä tulokset näyttävät osoittavan, että herbisidien ja niitä vastaavien vasta-aineiden väliset vuorovaikutukset ovat luonteeltaan pääasiassa hydrofobisia. Epäpolaaristen liuottimien läsnäolo vähentää vasta-aineen ja analyytin vuorovaikutuksen hydrofobista sitoutumiskomponenttia. Se vaikuttaa kuitenkin myös hydrofobisten sidosten vakauteen, säilyttää vasta-aineen tertiäärirakenteen ja johtaa antigeenin vapautumiseen. Nämä esimerkit, jotka liittyvät atratsiinin tai isoproturonin eluoitumiseen vastaavasta IS:stä, osoittavat, että tehokas eluoituminen saadaan aikaan lisäämällä suoraan suuri määrä metanolia tai ACN:ää, 70-80 %, eluointifraktioon. Tämä suuri määrä orgaanista modifiointiainetta mahdollistaa eluutiojakeen tilavuuden pienentämisen mahdollisimman paljon, mikä mahdollistaa analyytin konsentroinnin eluaatissa. On huolehdittava siitä, että sidostavan valinta on yhteensopiva näiden eluutio-olosuhteiden kanssa. Ei-kovalenttisen sidoksen käyttö estää mahdollisuuden käyttää näin suurta määrää modifiointiainetta ilman riskiä, että vasta-aineiden sitoutuminen sorbenttiin häiriintyy. Sol-gel-prosessin käyttö vasta-aineiden immobilisoinnissa rajoittaa myös mahdollisuutta käyttää suurta määrää orgaanista liuotinta. On osoitettu, että suuri määrä orgaanista modifiointiainetta, kuten vasta-aineita, aiheuttaa vasta-aineiden huuhtoutumista sol-geelimatriisista.8

Joskus tarvitaan orgaanisen liuottimen ja orgaanisen hapon yhdistelmää. Kuvassa 6 esitetään myös 2,4,6-trikloorifenolin ja pentakloorifenolin eluoitumisprofiili anti-pentakloorifenoli-IS:stä käyttäen hydro-orgaanista seosta, kun eluointiliuokseen on lisätty happoa ja kun siihen ei ole lisätty happoa. Trikloorifenoli voitiin ottaa kokonaan talteen käyttämällä joko vettä/ACN:ää (20:80, v/v) tai vettä/ACN:ää (30:70, v/v), joka oli happamoitunut pH:ssa 3 käyttäen trifluorietikkahappoa (TFA). Kun happamoituminen saavutettiin 1 % (v/v) etikkahapolla (AA), vain 30 % ACN:ää sisältävä seos oli tehokas eluutioon. Sitä vastoin pentakloorifenolin, jolla on suurempi affiniteetti PAbs:iin kuin trikloorifenolilla, eluoituminen oli mahdotonta puhtaalla ACN:llä tai TFA:lla happamoitetulla ACN:llä. Desorptio saatiin aikaan vain vedellä/ACN 20:80 (v/v), joka sisälsi 1 % AA:ta (v/v).

Siten useimmissa off-line-menetelmissä, myös niissä, joissa suositellaan käytettäväksi kertakäyttöisiä kaupallisia IS:iä, desorptio saadaan aikaan korkealla orgaanisen liuottimen prosenttimäärällä, joskus matalalla pH:lla.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että eluutio-olosuhteiden valitseminen riippuu ensi sijassa vasta-aineiden ja analyyttien välisestä affiniteetista. Se riippuu myös analyytin luonteesta, koska antigeenin ja vasta-aineen vuorovaikutukseen osallistuvien elektronisten ja hydrofobisten vuorovaikutusten välinen suhde vaikuttaa. Lopuksi se riippuu vasta-aineiden immobilisointistrategiasta; ei-kovalenttinen sitoutuminen estää suurten orgaanisten liuottimien käytön.