Jotkut entsyymit auttavat hajottamaan suuria ravintomolekyylejä, kuten proteiineja, rasvoja ja hiilihydraatteja, pienemmiksi molekyyleiksi. Tämä prosessi tapahtuu ruoansulatuksen aikana eläinten vatsassa ja suolistossa. Muut entsyymit ohjaavat pienemmät, pilkotut molekyylit suolen seinämän läpi verenkiertoon. Taas toiset entsyymit edistävät suurten, monimutkaisten molekyylien muodostumista pienistä, yksinkertaisista molekyyleistä solun rakenneosien tuottamiseksi. Entsyymit vastaavat myös lukuisista muista toiminnoista, joihin kuuluvat energian varastointi ja vapautuminen, lisääntymisen kulku, hengitysprosessit ja näkö. Ne ovat välttämättömiä elämälle.

Kukin entsyymi pystyy edistämään vain yhdenlaista kemiallista reaktiota. Yhdisteitä, joihin entsyymi vaikuttaa, kutsutaan substraateiksi. Entsyymit toimivat tiukasti järjestetyissä aineenvaihduntajärjestelmissä, joita kutsutaan reiteiksi. Näennäisen yksinkertainen biologinen ilmiö – esimerkiksi lihaksen supistuminen tai hermoimpulssin välittäminen – sisältää itse asiassa suuren määrän kemiallisia vaiheita, joissa yksi tai useampi kemiallinen yhdiste (substraatti) muuttuu tuotteiksi kutsutuiksi aineiksi; aineenvaihduntareitin yhden vaiheen tuote toimii substraattina reitin seuraavalle vaiheelle.

Ensyymien roolia aineenvaihduntareiteissä voidaan havainnollistaa kaavamaisesti. Kemiallinen yhdiste, jota edustaa A (ks. kaavio alla), muunnetaan tuotteeksi E entsyymikatalysoitujen vaiheiden sarjassa, jossa muodostuu peräkkäin väliyhdisteitä, joita edustavat B, C ja D. Ne toimivat substraatteina entsyymeille 2, 3 ja 4. Yhdiste A voidaan myös muuntaa toisen vaihesarjan kautta, joista osa on samoja kuin E:n muodostumisreitin vaiheet, tuotteiksi, joita edustavat G ja H.

Kirjaimet kuvaavat kemiallisia yhdisteitä; numerot kuvaavat yksittäisiä reaktioita katalysoivia entsyymejä. Suhteelliset korkeudet edustavat yhdisteiden termodynaamista energiaa (esim. yhdiste A on energiarikkaampi kuin B, B energiarikkaampi kuin C). Yhdisteet A, B jne. muuttuvat hyvin hitaasti ilman katalyyttiä, mutta muuttuvat nopeasti katalyyttien 1, 2, 3 jne. läsnä ollessa.

Entsyymien säätelevää roolia aineenvaihduntareiteissä voidaan selventää käyttämällä yksinkertaista analogiaa: kaavion kirjaimilla esitettyjen yhdisteiden ja rinteessä olevien, toisiinsa kytkettyjen vesisäiliöiden välillä. Vastaavasti numeroin esitetyt entsyymit ovat analogisia säiliöjärjestelmän venttiileille. Venttiilit säätelevät veden virtausta säiliössä; eli jos vain venttiilit 1, 2, 3 ja 4 ovat auki, vesi virtaa A:ssa vain E:hen, mutta jos venttiilit 1, 2, 5 ja 6 ovat auki, vesi virtaa A:ssa G:hen. Vastaavalla tavalla, jos aineenvaihduntareitin entsyymit 1, 2, 3 ja 4 ovat aktiivisia, muodostuu tuote E, ja jos entsyymit 1, 2, 5 ja 6 ovat aktiivisia, muodostuu tuote G. Metaboliareitin entsyymien aktiivisuus tai aktiivisuuden puute määrää siis yhdiste A:n kohtalon, eli se joko pysyy muuttumattomana tai muuttuu yhdeksi tai useammaksi tuotteeksi. Lisäksi, jos tuotteita muodostuu, entsyymien 3 ja 4 aktiivisuus suhteessa entsyymien 5 ja 6 aktiivisuuteen määrittää muodostuvan tuotteen E määrän verrattuna tuotteeseen G.

Veden virtaus ja entsyymien aktiivisuus noudattavat termodynamiikan lakeja; näin ollen vesi säiliössä F ei voi virrata vapaasti H:een avaamalla venttiili 7, koska vesi ei voi virrata ylämäkeen. Jos kuitenkin venttiilit 1, 2, 5 ja 7 ovat auki, vesi virtaa F:stä H:een, koska energia, joka säilyy veden virratessa alamäkeen venttiilien 1, 2 ja 5 kautta, riittää pakottamaan veden ylöspäin venttiilin 7 kautta. Vastaavalla tavalla aineenvaihduntareitin entsyymit eivät voi muuttaa yhdistettä F suoraan H:ksi, ellei energiaa ole saatavilla; entsyymit pystyvät käyttämään energiaa säästävien reaktioiden energiaa katalysoidakseen energiaa vaativia reaktioita. Entsyymikatalysoidun hiilihydraattien hapettumisen aikana hiilidioksidiksi ja vedeksi energia säilyy energiarikkaana yhdisteenä, adenosiinitrifosfaattina (ATP). ATP:n sisältämä energia hyödynnetään energiaa kuluttavan prosessin, kuten entsyymikatalysoidun lihassupistuksen aikana.

Koska solujen ja organismien tarpeet vaihtelevat, entsyymien aktiivisuuden lisäksi myös niiden synteesiä on säädeltävä; esimerkiksi säärilihaksen lihastoiminnasta vastaavat entsyymit on aktivoitava ja estettävä sopivina aikoina. Jotkut solut eivät tarvitse tiettyjä entsyymejä; esimerkiksi maksasolu ei tarvitse lihasentsyymiä. Bakteeri ei tarvitse entsyymejä metaboloidakseen aineita, joita ei ole sen kasvualustassa. Joitakin entsyymejä ei siis muodostu tietyissä soluissa, toisia syntetisoidaan vain tarvittaessa, ja taas toisia esiintyy kaikissa soluissa. Entsyymien muodostumista ja toimintaa säätelevät geneettisten mekanismien lisäksi myös sisäeritysrauhasten orgaaniset eritteet (hormonit) ja hermoimpulssit. Myös pienillä molekyyleillä on tärkeä rooli (ks. jäljempänä Entsyymien joustavuus ja allosterinen ohjaus).

Jos entsyymi on joltain osin viallinen, voi syntyä sairaus. Kaaviossa numeroilla 1-4 esitettyjen entsyymien on toimittava lähtöaineen A muuttuessa tuotteeksi E. Jos jokin vaihe estyy, koska entsyymi ei pysty toimimaan, tuotetta E ei välttämättä muodostu; jos E on välttämätön jollekin elintärkeälle toiminnalle, syntyy sairaus. Monet ihmisen perinnölliset sairaudet ja tilat johtuvat jonkin entsyymin puutteesta. Osa näistä on lueteltu taulukossa. Albinismi esimerkiksi johtuu perinnöllisestä kyvyttömyydestä syntetisoida tyrosinaasientsyymiä, joka katalysoi yhtä vaihetta polulla, jolla hiusten ja silmien väriaine muodostuu.