1 Jotta tämä yleinen yhtälö voitaisiin muuttaa sellaiseksi, joka olisi käyttökelpoinen fenyylialaniinikuormituskokeiden tulosten analysoinnissa, kukin näistä nopeustermeistä on korvattava nopeusyhtälöillä, jotka kuvaavat kolmea kyseessä olevaa aineenvaihduntaprosessia. Kun tarvittavia tietoja ei ollut saatavilla, oli tehtävä jäljempänä käsiteltyjä oletuksia.

Aluksi on huomattava, että aiempaa yritystä tehdä tällainen analyysi haittasi se, että ihmisen PAH:n ja ihmisen fenyylialaniinitransaminaasin kineettisiä ominaisuuksia koskevia tietoja ei ollut saatavilla. Jälkimmäisen entsyymin osalta ei edes tiedetty varmuudella, mikä entsyymi on vastuussa tästä aktiivisuudesta in vivo. Koska in vitro -näyttö osoitti, että fenyylialaniini on erinomainen substraatti mitokondriaaliselle aspartaattiaminotransferaasille, oletettiin, että kyseessä on kyseinen transaminaasi. Koska ihmisen vastaavan entsyymin ominaisuuksia ei tunneta, käytettiin vastaavan rottien entsyymin kineettisiä ominaisuuksia (12). Jäljempänä käsitellään tapaa, jolla ihmisen transaminaasia koskevaa ongelmaa käsiteltiin tässä analyysissä.

Rekombinantti-ihmisen PAH:n kineettiset ominaisuudet ovat nyt saatavilla (16, 17). PAH:n kinetiikkaa mutkistaa jonkin verran se, että fenyylialaniini toimii paitsi entsyymin substraattina myös aktivaattorina (ks. viite 1 ja siinä olevat viittaukset). Koska aiempi analyysi PAH:n kineettisestä käyttäytymisestä, joka perustui kahden paikan malliin, jossa fenyylialaniini sitoutuu järjestäytyneesti sekä katalyyttiseen paikkaan että säätelypaikkaan, pystyi riittävällä tavalla selittämään monet entsyymin kineettisen käyttäytymisen erityispiirteet (18), tässä analyysissä käytettiin samankaltaista järjestäytyneeseen sitoutumiseen perustuvaa kahden paikan mallia. Käytetty varsinainen nopeusyhtälö (19) on esitetty yhtälössä 2, jossa Km on fenyylialaniinin konsentraatio, joka antaa puolimaksimaalisen nopeuden, ja Ka on fenyylialaniinin konsentraatio, joka antaa puolimaksimaalisen aktivaation kokeessa, jossa PAH:ta esi-inkuboitiin vaihtelevien fenyylialaniinipitoisuuksien kanssa. Tässä analyysissä käytettiin seuraavia kineettisiä vakioita, jotka määritettiin puhtaalla ihmisen rekombinantti-PAH:lla 37 °C:ssa BH4:n ollessa koentsyyminä: Km fenyylialaniinille 0,51 mM ja Ka fenyylialaniinille aktivaattorina 0,54 mM (D. Kowlessur ja S.K., julkaisemattomat tiedot). Ihmisen PAH:n Vmax-arvon likiarvo (16) (luultavasti aliarvio) laskettiin seerumin fenyylialaniinipitoisuuden alkuarvon alenemisnopeudesta (0,9 μmol/ml/h) kontrollihenkilöillä sen jälkeen, kun he olivat saaneet suun kautta l-fenyylialaniinikuorman, joka riitti nostamaan seerumin fenyylialaniinipitoisuuden ≈17-kertaiseksi (20). 2 Kuten edellä todettiin, tässä analyysissä ohitettiin aiempi ongelma, joka koski fenyylialaniinin transaminaatiosta vastaavan entsyymin tunnistamista ihmisessä. Oletettiin, että fenyylialaniinin nettohäviämisen pääasiallinen reitti klassisilla PKU-potilailla on transaminaatio. Esimerkiksi, kuten jo mainittiin, fenyylialaniinin erittyminen virtsaan on vain ≈11 % transaminoituvasta määrästä, ja ensimmäisen elinvuoden loppuun mennessä voidaan arvioida, että proteiineihin sisällyttämällä hävitetyn fenyylialaniinin määrä on vain ≈25 % transaminaation kautta hävitetystä määrästä. On huomattava, että nykyisessä fenyylialaniinitransaminaasin nopeuden arviointimenetelmässä, joka perustuu fenyylialaniinin poistumisnopeuteen verestä, vähäiset fenyylialaniinin hävittämisreaktiot, kuten sen erittyminen virtsaan ja sen liittyminen proteiineihin, sisällytetään transaminaasiaktiivisuuden arvioon, mikä johtaa aktiivisuuden pieneen yliarviointiin.

Tämässä analyysissä tarvitaan transaminaasin Km- ja Vmax-arvot. Fenyylialaniinin transaminaation Km-arvoa on yritetty poimia klassisilla PKU-potilailla tehtyjen fenyylialaniinikuormituskokeiden tuloksista (21). Ihmisen transaminoituvan entsyymin Vmax-arvoa arvioitaessa käytettiin tietoja kaikkien transaminaatiosta peräisin olevien aineenvaihduntatuotteiden (fenyylipyruvaatti, fenyylilaktaatti ja o-hydroksifenyyliasetaatti) summasta, jotka erittyvät klassista PKU:ta sairastavien potilaiden ryhmästä plasman fenyylialaniinipitoisuuden funktiona. Suurin erittyvä määrä, ilmaistuna mmol/mol kreatiniinia, oli 1370, taso, joka näytti saavuttavan tasotason plasman fenyylialaniinipitoisuuksilla, jotka olivat välillä 1200 ja 2400 μmol/litra (22).

Yrityksiä muuntaa tämä arvo transaminaationopeudeksi hankaloittaa tutkimuksessa käytetyn potilasnäytteen laaja ikähaarukka, joka vaihteli kahdesta kahteen vuoteen ja 18 vuoteen. Tässä analyysissä oletettiin, että potilaiden keskimääräinen ruumiinpaino oli 50 kg ja että päivittäinen kreatiniinin erittyminen oli 2 g/24 h (23). Lisäksi oletettiin, että transaminaasista peräisin olevien metaboliittien erittyminen tapahtuu lineaarisesti 24 tunnin aikana ja heijastaa näiden metaboliittien muodostumisnopeutta. Oletettiin myös, että nämä yhdisteet tasapainottuvat kaikkien kehon nestekompartimenttien kanssa lukuun ottamatta tiheää ruston sidekudosta ja luuta, jotka yhdessä muodostavat 15 prosenttia kehon kokonaisvedestä (24), jolloin käytettävissä olevan veden jakautumistilavuudeksi saadaan 500 ml/kg kehon painoa. Näiden oletusten perusteella transaminaation maksiminopeudeksi laskettiin 0,043 μmol/ml/h.

Fenyylialaniinin aineenvaihdunnan lisätuote, joka on ainakin osittain peräisin fenyylipyruvaatista ja jota ei mitattu Langenbeckin ym. tutkimuksessa (22), on fenyyliasetyyliglutamiini (PAG). On näyttöä siitä, että PAG:tä voidaan muodostaa fenyyliasetaatista, joka on peräisin fenyylipyruvaatista oksidatiivisen dekarboksylaation avulla (25). On myös ehdotettu, että fenyyliasetaattia ja siten PAG:tä voidaan muodostaa fenyylialaniinista reittiä, johon ei liity transaminaatiota vaan dekarboksylaatio fenyylietyyliamiiniksi, jota seuraa amiinin hapettuminen fenyyliasetaatiksi (26). Havainto, jonka mukaan PKU-potilailla erittyvän fenyylietyyliamiinin määrä on pieni myös sen jälkeen, kun amiinin hapettuminen oli estetty amiinioksidaasin estäjän antamisella (27), osoittaa kuitenkin, kuten aiemmin käsiteltiin (12), että fenyylialaniinin dekarboksylaatio on määrällisesti vähäinen reitti fenyylialaniinin aineenvaihdunnassa sekä PAG:n muodostuksessa.

Normaalien henkilöiden erittämä PAG:n määrä on 250-500 mg/vrk; PKU-potilaat erittävät kaksinkertaisen määrän (28). Transaminaasireitin kautta muodostuvan PAG:n määrän laskemiseksi tehtiin konservatiivinen oletus, että vain potilaiden erittämä ”ylimääräinen” määrä on peräisin fenyylipyruvaatista. Kun keskimääräiseksi ylimääräiseksi erittyvän PAG:n määräksi otettiin 350 mg/vrk ja tehtiin samat edellä esitetyt oletukset, tämä erittyminen vastaa PAG:n muodostumisnopeutta 0,020 μmol/ml/h, jolloin kaikkien transaminoitujen tuotteiden muodostumisnopeudeksi saatiin 0,063 μmol/ml/h.

Käyttämällä tätä arvoa Vmax:lle laskettiin klassisilla PKU-potilailla tehdyn fenyylialaniinikuormituskokeen tulokset (21).37 ± 0,14 mM (keskiarvo ± SD, n = 3) fenyylialaniinitransaminaasin Km-arvoksi.

Koska tässä analyysissä PAH- ja transaminaasiaktiivisuus lasketaan veren fenyylialaniinipitoisuuksien funktiona, on tärkeää, että nämä pitoisuudet heijastavat aminohapon kudostasoja. PKU-potilaan maksakudoksen (29) sekä hyperfenyylialanemiaa sairastavien rottien maksa- ja munuaiskudoksen (30) fenyylialaniinipitoisuuksien on raportoitu olevan verrattavissa veren vastaaviin pitoisuuksiin.

Yhtälön 2 kolmas termi, proteiinien nettohajoamisnopeus, arvioitiin Waterlow’n ja Jacksonin (31) tiedoista, jotka osoittavat, että paastotilassa, tilassa, jossa fenyylialaniinikuormituskoe suoritetaan, proteiinien nettohajoaminen (ts, hajoavan proteiinin määrä vähennettynä syntetisoidulla määrällä) on 0,30 g/kg ruumiinpainoa 12 tunnin aikana. Koska luurankolihakset muodostavat ≈40 % kehon massasta (24) ja proteiinikatabolialla tässä kudoksessa on suuri merkitys aminohappojen toimittamisessa periferiaan, proteiinien hajoamista luurankolihaksissa pidettiin vallitsevana tapahtumana proteiinien hajoamisessa paaston aikana.

Ihmisen luurankolihakset sisältävät ≈46 μmol fenyylialaniinia/g kudosta (32). Tämän arvon ja sen havainnon perusteella, että aikuisen ihmisen lihas sisältää 19,8 % proteiinia (33), voidaan arvioida, että lihas sisältää 232 μmol fenyylialaniinia/g lihasproteiinia. Jos tätä arvoa pidetään edustavana elimistön proteiinivarastoille, se osoittaisi, että paaston aikana vapautuisi ≈70 μmol fenyylialaniinia/kg ruumiinpainoa 12 tunnin aikana. Jos käytetään samoja oletuksia kuin edellä fenyylialaniinin transaminaationopeuden arvioinnissa, viimeksi mainittu arvo vastaa proteiinien nettohajoamisen (ja fenyylialaniinin vapautumisen) tuntinopeutta 0,012 μmol/ml/h. Koska tämän reaktion substraatti eli elimistön proteiinivarastot pysyisivät luultavasti suhteellisen vakiona lyhyen paastojakson aikana, proteiinien hajoamisen oletettiin noudattavan nollan kertaluvun kinetiikkaa.

Substituoimalla yhtälössä 1 esitettyjen kolmen reaktion kineettisten vakioiden arvioidut arvot saadaan yhtälö 3: 3

Viime aikoina PKU-potilaat luokiteltiin luokittelemalla heidät fenotyyppisiin luokkiin ruokavaliossa nautitun fenyylialaniinin sietokyvyn perusteella. Klassista PKU:ta sairastavat potilaat sietävät alle 20 mg/kg fenyylialaniinia päivässä pitääkseen veren fenyylialaniinipitoisuuden hyväksytyllä 0,3 mM:n tasolla, ”keskivaikeaa PKU:ta” sairastavat potilaat sietävät 20-25 mg/kg päivässä ja ”lievää PKU:ta” sairastavat potilaat sietävät 25-50 mg/kg päivässä (42).

Tarkistaaksemme, ovatko nämä ravinnon fenyylialaniinin sietoarvot johdonmukaisia yhtälön 3 ennusteiden kanssa, oletettiin, että sallitun fenyylialaniinimäärän saanti jaettiin tasan kolmelle ”aterialle”. Klassista PKU:ta sairastavilla potilailla, joiden fenyylialaniinin saanti on 15 mg/kg päivässä, jokainen ateria sisältäisi 5 mg/kg päivässä ja lisäisi 0,06 μmol/ml perusarvoon 0,30 μmol/ml, jolloin plasman fenyylialaniinin kokonaispitoisuus olisi 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Kun tämä arvo korvataan yhtälöön 3 (olettaen, että klassisen PKU-potilaan Vmax on nolla), -dPhe/dt on 0,001 μmol/ml tunnissa, eli tällä fenyylialaniinipitoisuudella fenyylialaniinin häviämisnopeus transaminaatioreaktion kautta on juuri ja juuri suurempi kuin fenyylialaniinin tulonopeus plasman altaaseen proteiinien nettohajoamisen kautta. Siksi yhtälö 3 ennustaa, että nämä PKU-potilaat voisivat sietää fenyylialaniinin saantia 15 mg/kg päivässä.

Samalla tavalla laskettuna ”keskivaikeaa PKU:ta” sairastavat potilaat, joiden fenyylialaniinin sietokyky ruokavaliossa on 25 mg/kg päivässä, tarvitsisivat PAH:n jäännösaktiivisuutta 15 % villityypin aktiivisuudesta, jotta he pystyisivät metaboloimaan fenyylialaniinia 3:ssa.Vastaavasti ”lievää PKU:ta” sairastavat potilaat, joiden fenyylialaniinin sietokyky on 50 mg/kg päivässä, tarvitsisivat PAH:n jäännöstason, joka olisi 25 % villityypin tasosta, jotta lisätty fenyylialaniini metaboloituisi noin 3 tunnissa.Nämä tulokset osoittavat, että yhtälö 3 voi selittää näissä eri potilasryhmissä havaitun ruokavalion fenyylialaniinin sietokyvyn.

Olisi hyödyllistä yrittää korreloida näitä arvioita ”lievää PKU:ta” ja ”keskivaikeaa PKU:ta” sairastavien potilaiden PAH:n jäännösaktiivisuudesta in vitro mitattuun jäännöshydroksylaasiaktiivisuuteen potilailta löydetyille mutanttisille PAH-lajeille. Tällä hetkellä tällainen yritys on kuitenkin hankalaa, koska in vitro -tiedoissa on liikaa hajontaa. Näin ollen useilla potilailla, jotka on luokiteltu ”kohtalaiseksi PKU:ksi” (42), on todettu olevan seuraavat kolme PAH-mutanttimuotoa (niiden in vitro -jäännösaktiivisuus ilmaistuna prosentteina villin tyypin aktiivisuudesta on suluissa): L348V (25 %), R261Q (30 %, 47 %) ja R158Q (10 %) (43). Voidaan nähdä, että nämä arvot vaihtelevat lähes viisinkertaisesti. Kuten aiemmin on käsitelty (2, 43), PAH-mutanttien in vitro -arviot jäännöshydoksylaasiaktiivisuudesta ovat yleensä korkeampia kuin maksabiopsioissa havaitut arviot. Ainakin yksi syy tähän suuntaukseen on se, että in vitro PAH-aktiivisuus mitataan tavallisesti käyttämällä tyydyttäviä fenyylialaniini- ja BH4-pitoisuuksia, kuten tehtiin mutantille R261Q (44). Tässä tilanteessa on mahdollista, että yhtälön 3 avulla arvioidut PAH:n jäännösaktiivisuudet saattavat osoittautua in vivo -aktiivisuuksia paremmin kuvaaviksi kuin in vitro mitatut aktiivisuudet.

Tämä fenyylialaniinin metabolian malli on merkityksellinen Thompsonin ja hänen kollegoidensa (45, 46) johtopäätöksen kannalta, jonka he tekivät niiden tulosten perusteella, jotka he saivat infusoimalla koehenkilöihin deuteriumleimattua fenyylialaniinia ja tyrosiinia, ja jonka mukaan klassisilla PKU:ta sairastavilla potilailla on ”huomattavan paljon” PAH:n aktiivisuutta, joka on yhtä suuri kuin vertailuhenkilöillä, eli se vastaa n. 76 %. Tämä hämmästyttävän korkea fenyylialaniinia hydroksyloiva aktiivisuus johtui tyrosiinihydroksylaasista (45). Kuten edellä todettiin, kuvassa 2 esitetyt tulokset osoittavat, että ilman PAH:ta fenyylialaniiniannos poistuu verestä alle 3 prosenttia nopeammin kuin kontrolleilla. Tämän analyysin perusteella ei ole viitteitä siitä, että ihmisillä olisi olemassa jokin vaihtoehtoinen reitti, joka voisi hävittää suuria määriä fenyylialaniinia. Hiljattain van Spronsen ym. (34) ovat huomauttaneet mahdollisesta metodologisesta ongelmasta, joka liittyy Thompsonin ja työtovereiden käyttämään menetelmään.

Yhteenvetona voidaan todeta, että PAH-aineenvaihdunnan mallilla saadut kvantitatiiviset tulokset ovat johdonmukaisia sellaisten tietojen kanssa, jotka epäsuorasti kuvastavat PAH:n in vivo -toimintaa, kuten veren fenyylialaniinipitoisuudet vakaassa tilassa, fenyylialaniinin puhdistumisnopeudet (tavanomaisesti ilmaistuna t2/2-arvoina) verestä fenyylialaniinikuormituksen jälkeen ja fenyylialaniinin sietokyky ruokavaliosta. Mallilla voidaan arvioida kvantitatiivisesti PAH:n jäännösaktiivisuutta mistä tahansa näistä arvoista, erityisesti fenyylialaniinikuormituksen mitatuista puhdistumisnopeuksista. Ennustetut jäännös-PAH-tasot tai niistä johdetut arvot voivat olla hyödyllisiä tehtäessä päätöksiä siitä, kuinka tiukkaa fenyylialaniinin ruokavalion rajoittamisen on oltava halutun veren fenyylialaniinipitoisuuden saavuttamiseksi. Taulukossa 1 esitetään yhteenveto yhtälön 3 avulla lasketuista t1/2-arvoista ja veren vakaan tilan fenyylialaniinipitoisuuksista (olettaen, että fenyylialaniinia ei saada koejakson aikana) PAH:n jäännösaktiivisuuden eri tasoilla sekä vertailukelpoiset arvot asiaa koskevista kliinisistä tiedoista.