Soluviljely, viruksen monistaminen ja puhdistaminen SHAPE-MaP- ja SPLASH-kokeita varten

Madin-Darbyn naudan munuaiset (MDBK) ja Madin-Darbyn koiranmunuaiset (MDCK) kasvatettiin minimaalisessa välttämättömässä keskipitkänesteessä (Merck, Minimum Essential Medium, Merck), johon lisättiin 2 mM l-glutamiinia ja 10 %:ia fosfaattista viruskonsentraattia (FCS). WSN (H1N1) -viruskannat tuotettiin infektoimalla MDBK-soluja influenssaviruksella infektiokertoimella (MOI) 0,01. Udorn (H3N2) ja PR8 (H1N1) (PR8) -virusten viruskannat tuotettiin infektoimalla MDCK-soluja MOI:lla 0,001, kun läsnä oli 0,8 μg ml-1 n-tosyyli-l-fenyylialaniinikloorimetyyliketonilla (TPCK) käsiteltyä trypsiiniä (Merck). Virukset kerättiin 2 d infektion jälkeen. Virukset puhdistettiin ultrasentrifugoimalla: ensin infektoitu soluviljelmän väliaine kirkastettiin sentrifugoimalla 4 000 kierrosnopeudella 10 minuutin ajan 4 °C:ssa ja sen jälkeen sentrifugoimalla 10 000 kierrosnopeudella 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Tämän jälkeen virus puhdistettiin sentrifugoimalla 30 prosentin sakkaroosityynyn läpi 25 000 kierrosnopeudella 90 minuutin ajan 4 °C:ssa SW 32 -roottorissa (Beckman Coulter). Puhdistettu viruspelletti resuspendoitiin resuspension puskuriin (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Huomaamme, että ultracentrifugointi ei häiritse virionin eikä RNA:n tertiäärirakenteita30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP suoritettiin julkaistujen ohjeiden mukaisesti17; 1-metyyli-7-nitroisatoiinihappoanhydridi (1M7) syntetisoitiin 4-nitroisatoiinihappoanhydridistä aiemmin kuvatulla tavalla33. In vitro transkriboidun RNA:n kokeita varten kukin viruksen RNA-segmentti syntetisoitiin lineaarisesta DNA-templaatista HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kitillä (New England Biolabs). Tuotteiden koko ja puhtaus tarkistettiin 3,5-prosenttisella polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE-geelillä). Alastomat virus-RNA-näytteet valmistettiin puhdistamalla WSN-partikkelit sakkaroosityynyllä aiemmin kuvatulla tavalla. Puhdistettuja viruksia käsiteltiin 250 μg ml-1 proteinaasi K:lla (Roche) proteinaasi K-puskurissa (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS) 40 minuutin ajan 37 °C:ssa. Ennen modifiointia in vitro transkriptoitua RNA:ta ja alastomia viruksen RNA-näytteitä laskostettiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan laskostuspuskurissa (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Taitettuun RNA:han lisättiin 1M7 (liuotettuna vedettömään dimetyylisulfoksidiin (DMSO; Merck)) 10 mM:n loppupitoisuuteen ja näytteitä inkuboitiin 75 s 37 °C:ssa. In virio -muutokset tehtiin lisäämällä 1M7 suoraan puhdistettuun virukseen. SHAPE-MaP-reagenssien kykyä tunkeutua viruspartikkeleihin testattiin aluksi aiemmin kuvatulla tavalla34 tekemällä 32P-merkittyjä alukkeen pidennyksiä SHAPE-MaP-reagenssilla käsitellystä viruksesta uutetulle RNA:lle NA-segmenttiin kohdistuvalla alukkeella (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGAGACG-3′). Samanaikaisesti 1M7-käsiteltyjen näytteiden kanssa kontrollinäytteet käsiteltiin DMSO:lla. n-metyyli-isatoiinihappoanhydridiä (NMIA; Thermo Fisher Scientific) SHAPE-MaP-reagenssilla testattiin myös virio. Kokeet NMIA:lla tehtiin kuten 1M7:n kohdalla kuvattiin, paitsi että puhdistettuja virioneja käsiteltiin NMIA:lla 45 minuutin ajan.

Sekvensointikirjaston valmistelu suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla17 randomer-työnkulun mukaisesti. Lyhyesti sanottuna 1M7- tai kontrollikäsittelyn jälkeen RNA puhdistettiin RNA Clean & Concentrator-5 Kitillä (Zymo Research). RNA käänteistranskriboitiin käyttämällä Random Primer Mix (New England Biolabs) SuperScript II:lla (Invitrogen) MaP-puskurissa (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM ditiotreitoli ja 0,5 mM deoksinukleosiditrifosfaattia). DNA-kirjastojen valmistukseen käytettiin Nextera XT DNA Library Prep Kit -pakettia (Illumina). Lopulliset PCR-monistustuotteet kokoselektoitiin Agencourt AMPure XP Beads -helmillä (Beckman Coulter) ja niiden laatu arvioitiin Agilent DNA 1000 -kitillä (Agilent Technologies) Bioanalyzer 2100 -järjestelmässä (Agilent Technologies). WSN:n, alastoman viruksen RNA:n ja in vitro transkriptoidun RNA:n osalta kirjastot sekvensoitiin (2 × 150 emäsparia (bp)) HiSeq 4000 -järjestelmällä (Illumina); PR8- ja Udorn-virusten osalta kirjastot sekvensoitiin (1 × 150 bp) NextSeq 500 -järjestelmällä (Illumina).

SPLASH

SPLASH-näytteet valmistettiin aiemmin julkaistulla tavalla24,35, muutamin muutoksin, kahdelle replikaatille kutakin WSN-, PR8- ja Udorn-virusta varten ja yhdelle replikaatille kutakin H3N2-reassortanttivirusta varten. Puhdistettua virusta inkuboitiin 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) ja 0,01 % digitoninin (Merck) kanssa 5 minuutin ajan 37 °C:ssa. Virus levitettiin 6-kuoppalevylle, peitettiin lasilevyllä, asetettiin jäälle ja säteilytettiin 45 minuutin ajan UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lampilla (Thermo Fisher Scientific). Ristisilloitettu virus käsiteltiin proteinaasi K:lla ja viruksen RNA uutettiin TRIzolilla (Invitrogen). Poistettua viruksen RNA:ta käytettiin biotiinin sisällyttämisen havaitsemiseen käyttämällä kemiluminesenssia sisältävää nukleiinihapon havaitsemismoduulikittiä (Thermo Fisher Scientific) Hybond-N-nylonikalvolla (GE Healthcare Life Sciences). Loput uutetusta virus-RNA:sta fragmentoitiin käyttämällä NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module -moduulia (New England Biolabs) ja kokoselektoitiin alle 200 nt:n pituiset fragmentit RNA Clean & Concentrator-5 Kitillä. Näytteet rikastettiin biotinyloidun virus-RNA:n osalta käyttämällä Dynabeads MyOne Streptavidin C1 -helmiä (Thermo Fisher Scientific); läheisyysligaatio ja psoraleenin ristisidoksen kumoaminen suoritettiin kuten aiemmin on julkaistu24,35. Sekvensointikirjastot valmistettiin kaupallisella SMARTer smRNA-Seq Kitillä (Clontech Laboratories). Lopullinen kokovalinta tehtiin ajamalla PCR:llä monistetut sekvensointikirjastot 6 %:n PAGE-geelillä (Thermo Fisher Scientific) Tris/Boorihappo/EDTA:ssa (TBE) ja valitsemalla 200-300 bp:n DNA. Kirjastot sekvensoitiin 1 × 150 bp NextSeq 500 -järjestelmässä.

SHAPE-MaP-sekvensointilukemien käsittely

Sekvensointilukemat leikattiin adapattorien poistamiseksi Skewer v0.2.2:lla (viite 36). SHAPE-MaP-reaktiivisuusprofiilit luotiin käyttämällä julkaistua ShapeMapper2-putkilinjaa37 , joka kohdistaa lukemat referenssigenomiin ja laskee mutaatiomäärät kussakin nukleotidipaikassa. Tämän jälkeen mutaationopeudet muunnetaan SHAPE-MaP-reaktiivisuusarvoiksi, jotka määritellään seuraavasti:

jossa mutr1M7 on nukleotidimutaationopeus 1M7-käsitellyssä näytteessä ja mutrDMSO on mutationopeus DMSO-käsitellyssä näytteessä. Kaikki SHAPE-MaP-reaktiivisuudet normalisoitiin likimäärin asteikolle 0-2 jakamalla SHAPE-MaP-reaktiivisuusarvot 10 %:n eniten reagoivien nukleotidien keskimääräisellä reaktiivisuudella sen jälkeen, kun poikkeavat nukleotidit oli suljettu pois (määritelty nukleotideiksi, joiden reaktiivisuusarvot ovat >1,5 kvartiiliväliä). Korkeat SHAPE-MaP-reaktiivisuudet viittaavat joustavampiin (eli yksisäikeisiin) RNA:n alueisiin ja matalat SHAPE-MaP-reaktiivisuudet viittaavat rakenteellisesti rajoitetumpiin (eli emäspareihin sidottuihin) RNA:n alueisiin.

SPLASH-sekvensointilukujen käsittely

Sekvensointilukuja leikattiin adapattoreiden poistamiseksi Skewer v0.2.2:lla (ref. 36). STAR v.2.5.3:n (viite 38) avulla lukemat kohdistettiin sopivaan viruksen referenssigenomiin (lisätaulukko 2). Jatkokäsittelyssä käytettiin vain kimeerisiä lukuja, joissa vähintään 20 nt oli kohdistettu referenssisegmentteihin (STAR-parametri: -chimSegmentMin 20). Kimeeriset lukemat deduplikoitiin käyttäen CIGAR-merkkijonoja ja kohdistusasemia. Kunkin lukukohdistuksen CIGAR-merkkijonot käsiteltiin lukujen alku- ja loppukoordinaattien löytämiseksi. Kimeeristen lukujen koordinaatteja käytettiin R-ohjelmistossa sekvenssien vuorovaikutusten matriisin tuottamiseen. Matriisin yksittäiset lokukset valittiin ja sovitettiin yksitellen Gaussin käyrällä, joka perustui lukujen päällekkäisyyden intensiteettiin, vuorovaikutusikkunan määrittelemiseksi; monimutkaisten päällekkäisten lokusten vuorovaikutusikkunat erotettiin yksittäisiin ikkunoihin. Vuorovaikutusikkunan leveyttä käytettiin kunkin vuorovaikutuksen alku- ja loppukoordinaattien määrittämiseen; vuorovaikutustiheyden mittarina käytettiin niiden lukemien lukemien lukumäärää, jotka olivat tällä alueella (tai osittain sillä). Kuvien tuottamista varten kunkin viruksen 20 parasta vuorovaikutusta visualisoitiin käyttämällä circlize-pakettia v.0.4.5 (ref. 39) R v.3.5.1:ssä. Vuorovaikutuslokusten koko joukko on esitetty lisätaulukossa 2. Vuorovaikutuslokusten qPCR-validointia varten valmistettiin ja rikastettiin psoraleeniristeytetyt näytteet aiemmin kuvatulla tavalla, mutta fragmentointiaikaa lyhennettiin (3 vs. 4 min) pidempien RNA-fragmenttien tuottamiseksi. RNA polyadenyloitiin Poly(A)-polymeraasilla (Takara Bio) ja komplementaarinen DNA tuotettiin käyttämällä smRNA dT Primeriä (Takara Bio) ja PrimeScript Reverse Transcriptasea (Takara Bio) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 50 syklin qPCR suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti StepOnePlus-laitteella (Applied Biosystems) käyttäen Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) ja alukepareja segmenttien välisten vuorovaikutusten testaamiseksi. Alukkeiden sekvenssit on esitetty lisätaulukossa 3. QPCR-monistamisen 50 syklin jälkeen tuotteet erotettiin 8 %:n PAGE:lla (29:1 akryyliamidi/bis-akryyliamidi, 1 × TBE-puskuri) ja visualisoitiin sinisen valon läpivalaisulla.

RNA-rakenneennusteiden ennustaminen

IntaRNA-algoritmi v.2..3.1 (ref. 40) käytettiin ennustamaan RNA-RNA-vuorovaikutusten kykyä esiintyä SPLASH-analyysin aikana tunnistetuilla alueilla käyttäen Exact mode (-mode E) ja no seed constraint (-noSeed) -vaihtoehtoja. SHAPE-MaP-reaktiivisuudet otettiin mukaan RNA-RNA-vuorovaikutusten mallintamiseen (-tShape ja -qShape). Permutoidut tietokokonaisuudet luotiin sekoittamalla satunnaisesti SPLASHin tunnistamia erityisiä vuorovaikutuskumppaneita ja arvioimalla vuorovaikutuksen ΔG-energioita IntaRNA:n avulla. SPLASHin tunnistamiin molekyylien välisiin RNA-vuorovaikutuksiin liittyvien ΔG-energioiden todennäköisyysjakaumien ja permutoitujen tietokokonaisuuksien välisen eron merkitsevyys laskettiin käyttämällä Wilcoxonin rank-summatestiä R-ohjelmistossa. IntaRNA-rakenne-ennusteita käytettiin sitten vuorovaikutusalueiden trimmaamiseen emäspareihin osallistuviin nukleotideihin. Jos SHAPE-MaP-dataa ei ollut saatavilla (PR8-reassortantit H3N2-virusten kanssa), kunkin RNA-juosteen esitaivutus (”saavutettavuus”) poistettiin IntaRNA:ssa käytöstä (-qAcc = N -tAcc = N). Validointia varten tunnettuja rakenteita vastaan RNA:n sekundäärirakennetiedot poimittiin RNA3Dhub-tietokannasta41, joka perustui 80S-ribosomin42 (PDB: 6EK0) ja U4/U6.U5-kolminkertaisen pienen nukleaarisen ribonukleoproteiinin spliceosomaalisen kompleksin43 (EMDB: EMD-2966) kryogeenisen elektronimikroskopian rakenteisiin. Referenssi-RNA-sekvenssit korjattiin vastaamaan naudan (MDBK) ribosomaalisen RNA:n ja U4/U6-pienten ydin-RNA:iden sekvenssejä aiemmin kuvatulla tavalla44. RNA:n intramolekulaarisen rakenteen ennustamiseen käytettiin ViennaRNA-pakettia v.2.0 (viite 45). RNAfold-komentoa käytettiin sekundääristen RNA-rakenteiden ja jakofunktioiden ennustamiseen kullekin segmentille. SHAPE-MaP-reaktiivisuudet otettiin mukaan pseudoenergiaa rajoittavina tekijöinä. Ex virio- ja in virio SHAPE-MaP-reaktiivisuusprofiilien välisen 50 nt:n liukuvan mediaani-ikkunan korrelaatioanalyysin avulla määritettiin T7-transkriptoidun ja vRNP-assosioituneen RNA:n välisen SHAPE-MaP-korrelaation laajuus. Havaitsimme, että korrelaatiota ei ollut >150 nt; sen vuoksi asetimme rakenteen ja partitiotoiminnan ennusteiden suurimmaksi pariliitosetäisyysrajoitteeksi 150 nt. Molekyylinsisäisiä rakenneennusteita varten asetimme promoottorialueella olevat nukleotidit yksisäikeisiksi.

Soluviljely influenssavirusten käänteismuokkausta varten

MDCK-solut ja ihmisen alkion munuaissolut (HEK 293T) hankittiin Melbournen yliopiston mikrobiologian ja immunologian laitoksen olemassa olevasta kokoelmasta. MDCK-soluja kasvatettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -mediassa (Sigma-Aldrich) ja HEK 293T-soluja DMEM:ssä (Thermo Fisher Scientific). Molempiin väliaineisiin lisättiin 10 % lämpöinaktivoitua FCS:ää, 2 mM l-glutamiinia, 2 mM natriumpyruvaattia, 24 μg ml-1 gentamysiiniä, 50 μg ml-1 streptomysiiniä ja 50 IU ml-1 penisilliiniä. MDCK-solujen ja HEK 293T-solujen kokoviljelmät transfektiota varten perustettiin Opti-MEM:ssä (Thermo Fisher Scientific), jossa oli 50 μg ml-1 streptomysiiniä ja 50 IU ml-1 penisilliiniä.

Käänteisesti muunnettujen influenssavirusten rakentaminen

PR8-, Udorn-, Mem71- (H3N2), PC73- (H3N2) ja Wyo03- (H3N2) -viruksista peräisin olevat yksittäiset geenisegmentit käänteistranskriboitiin käänteisellä transkriptiolla ja kloonattiin pHW2000-plasmideihin46. Käänteisellä genetiikalla saadut virukset sisälsivät joko PR8-, Udorn-, Mem71-, PC73- tai Wyo03-viruksen PB1-geenin ja joko villityyppisen tai muunnetun NA-geenin geneettisellä taustalla, joka sisälsi kuusi PR8-viruksen segmenttiä (PB2, PA, HA, NP, M ja NS). Muunnettu NA-geeni (Wyo03UdSub) oli peräisin Wyo03:sta, ja siinä oli neljä substituutiota Udorn-NA-sekvenssiin: nukleotidit G943A, C938U, U933C ja G923A. Kolme näistä neljästä nukleotidimuutoksesta oli hiljaisia, ja neljäs (A534G) johti konservatiiviseen lysiinin muuttumiseen arginiiniksi (K172R). Komplementaariset fragmentit, jotka sisälsivät nämä muutokset, tuotettiin PCR:llä ja yhdistettiin toisiinsa toisella PCR-kierroksella käyttäen segmenttispesifisiä alukkeita, jotka sisälsivät BsmBI-restriktiokohtia47 ; tuote kloonattiin pHW2000-ekspressiovektoriin viruksen pelastamista varten. Alukkeiden sekvenssit on esitetty lisätaulukossa 3. Pelastetut virukset monistettiin 10 d:n alkioituihin kananmuniin. Tarttuvan allantoisen nesteen viruspitoisuus titrattiin muodostamalla plakkeja MDCK-soluissa48 ja varastoitiin -80 °C:ssa.

Viruksen replikaatiokinetiikan määrittäminen käänteisesti muunnettujen virusten osalta

Käänteisesti muunnettujen virusten replikaatio-ominaisuudet määritettiin infektoimalla MDCK-soluja MOI:lla 0,01. 1 tunnin imeytymisen jälkeen (t = 0 h) inokulaatio poistettiin ja solut pestiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa, 5 % CO2:ssa RPMI 1640:ssä, jota täydennettiin 2 mM l-glutamiinilla, 2 mM natriumpyruvaatilla, 24 μg ml-1 gentamysiinillä, 50 μg ml-1 streptomysiinillä, 50 IU ml-1 penisilliinillä ja 1 μg ml-1:llä TPCK:lla käsitellyllä trypsiinillä (Worthington Biochemical Corporation). Soluviljelmien supernatantit kerättiin eri ajankohtina infektion jälkeen ja säilytettiin -80 °C:ssa analysointia varten. Virustitterit määritettiin muodostamalla plakkeja MDCK-solujen juokseville monolayereille.

Influenssavirusten yhdeksän plasmidin kilpaileva käänteisgenetiikka

Influenssavirusten kilpaileva käänteisgenetiikka suoritettiin käyttämällä muunnettua versiota kahdeksan plasmidin käänteisgeneettisestä systeemistä26 , joka on kuvattu aiemmin25. Lyhyesti sanottuna PR8:n PB2-, PB1-, PA-, hemagglutiniini- (HA), nukleoproteiini- (NP), matriisiproteiini- (M) ja ei-rakenneproteiini- (NS) viruksen RNA-segmenttejä koodaavia plasmideja kootransfektoitiin plasmidien kanssa, jotka koodasivat neuraminidaasiviruksen (NA) RNA:ta ja kilpailevaa PB1-viruksen RNA:ta, joka oli peräisin Udornista, Mem71:stä, PC73:sta tai villistä tyypistä tai muunnetusta Wyo03:sta. Kukin plasmidi (1 µg) sekoitettiin FuGENE 6 -transfektioreagenssiin (Promega) Opti-MEM:ssä ja lisättiin HEK 293T- ja MDCK-solujen yhteiskulttuuriin. Kuusi tuntia transfektion jälkeen väliaine vaihdettiin Opti-MEM:ään, jota täydennettiin 50 μg ml-1 streptomysiinillä ja 50 IU ml-1 penisilliinillä. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin lisättiin TPCK-käsiteltyä trypsiiniä (1 μg ml-1) ja supernatantti kerättiin 42 tunnin kuluttua ja säilytettiin -80 °C:ssa. Kilpailevien PB1-geenien sisällyttämistaajuuksien määrittämiseksi transfektiosupernatantissa oleville jälkeläisviruksille tehtiin plakkitesti MDCK-soluissa. Satunnaisesti valitut plakit (noin 36 kappaletta koetta kohti) poimittiin ottamalla näytteitä agaroosin läpi ja resuspendoitiin 0,05-prosenttiseen Triton-X100:aan. Kilpailevien geenisegmenttien lähde tunnistettiin geenispesifisellä kvantitatiivisella RT-PCR:llä käyttäen SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR Kit (Bioline). Jokaisessa 20 μl:n reaktiossa käytettiin 5 μl plakkipoimittua virussuspensiota, 10 μl 2 × SensiFast SYBR No-ROX One-Step -seosta, 0,2 μl käänteistä transkriptaasia, 0,4 μl Ribosafe RNase -inhibiittoria, 0,8 μl kutakin 10 μM:n geenispesifistä eteenpäin- ja käänteistä aluketta ja 0,08 μl kutakin 25 μM:n geenispesifistä koetinta. Alukkeiden ja koettimien sekvenssit on esitetty lisätaulukossa 3. RT-PCR-reaktiota inkuboitiin 10 minuuttia 45 °C:ssa ennen qPCR-vahvistusta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ilmoitetut arvot ovat yhdistettyjä tietoja 3-8 riippumattomasta transfektiokokeesta kullekin kilpailulle.

Raportointiyhteenveto

Lisätietoa tutkimussuunnittelusta on saatavilla tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.