Invasion määritys

Materiaalit:

Falcon 24 kuopan kudosviljelylevy

Falcon soluviljelyinsertti:8μm huokoskoko, 24 kuopan formaatti

Cat# 3097

Matrigel (Diluted inDMEM/F12)

5% Glutaraldehydi in 1XPBS

0.5 % Toluidiinisininen 2 %:ssa Na2CO3:ssa

Boydenin kammion valmistelu:

1. Steriilejä pinsettejä käyttäen poista soluseinän insertit pakkauksistaan ja kuoppaise ne 24-kuoppalevyn kuoppiin.
2. Pese insertit 2 kertaa 300μl:lla DMEM/F12

(Varo pistämästä kalvoa)

1. Lisää 20μl 1:6 laimennettua Matrigeliä (2-3 mg/ml proteiinia) kunkin solukuopan inserttien keskelle. Levitä Matrigel varovasti koko kalvon pinnalle.
2. Aseta päällystetyt insertit inkubaattoriin, jotta Matrigel jähmettyy 20-30 minuutiksi.

Solujen valmistelu määritystä varten:

1. Käsittele ja kasvata soluja koeolosuhteiden mukaisesti. Saattaa olla suotavaa synkronoida solut samaan kasvutilaan.
2. Trypsinointi ja solujen laskeminen
3. Poista trypsiini ja resuspendoi tuoreella väliaineella.
4. Levitä 1X105 solua 200 μl:ssa määriteltyä elatusainetta ylempään kammioon.
5. Lisää 300 μl mediumia alempaan kammioon.
6. Viljellään noin 20 tuntia.

Aika vaihtelee eri solulinjoilla ja voi olla jopa 48 tuntia vähemmän invasiivisille soluille.

Fiksaatio ja värjäys:

1. Viljelyn jälkeen imetään väliaine alemmasta kammiosta
2. Lisätään 0,5 ml 5 %:sta glutaraldehydiä 1XPBS:ssä, inkuboidaan 10 min. @ R.T
3. Aspiroi glutaraldehydiliuos, pese jokainen kuoppa 3 kertaa D.W:llä
4. Lisää 0,5 ml 0,5 %:n Toluidine Blue -värjäysliuosta alempaan kammioon, inkuboi 10-20 min @ R.T
5. Hengitä liuos sekä ylä- että alakammiosta, pese alakammio 3 kertaa D.W:llä
6. Pyyhi yläkammion sisäpinta varovasti pumpulipuikolla. (Varo painamasta liian voimakkaasti, kalvo saattaa ponnahtaa ulos.) Tunkeutuneet solut ovat keskellä kalvon pohjaa.
7. Laske solujen lukumäärä mikroskoopin q 20X-objektiivilla. Laske vähintään 3 kenttää kalvoa kohti.