I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

entsyymireaktio (kuva aukeaa uuteen ikkunaan)

Kymotrypsiini on haiman acinarisolujen tuottama seriini-endopeptidaasi. Kymotrypsiini aktivoituu, kun trypsiini on proteolysoinut kymotrypsinogeenin. Trypsiini hydrolysoi lysiiniä ja arginiinia, mutta kymotrypsiini pilkkoo selektiivisesti aromaattisten jäännösten (tyrosiini, fenyylialaniini ja tryptofaani) muodostamia peptidisidoksia (Hedstrom ym. 1992). Kymotrypsiinin kahta vallitsevaa muotoa, A:ta ja B:tä, esiintyy naudan haimassa yhtä paljon. Ne ovat hyvin samankaltaisia proteiineja (80 % identtisiä), mutta niillä on merkittävästi erilaiset proteolyyttiset ominaisuudet (Hartley 1964, Meloun ym. 1966, Smillie ym. 1968 ja Gráf ym. 2004). Seuraavat tiedot koskevat ensisijaisesti kymotrypsinogeenin ja kymotrypsiinin A-muotoa.

Historia:

1900-luvun alussa Vernon ehdotti, että haimapreparaatit voisivat synnyttää omien entsyymiensä luontaisen aktivaattorin (Vernon 1901). Vernonin maidon hyytymiskokeissa todettiin, että entsyymejä oli ainakin kaksi ja että toinen oli vakaampi kuin toinen (Vernon 1902). Tämä ajatus hyväksyttiin kuitenkin laajalti vasta vuonna 1934, kun Kunitz ja Northrop vahvistivat, että trypsiinin lisäksi oli olemassa toinenkin entsyymi, ja nimesivät sen kymotrypsiiniksi. He pystyivät kiteyttämään kymotrypsiinin sekä sen inaktiivisen esiasteen, kymotrypsinogeenin (Kunitz ja Northrop 1934). Vuonna 1938 Kunitz eristi kymotrypsiinin eri aktiivisia muotoja ja nimesi ne alfa-, beeta- ja gammamuodoiksi (Kunitz 1938).

1940-luvun alussa Fruton ja Bergmann tutkivat edelleen kymotrypsiinin spesifisyyttä ja raportoivat useista uusista substraateista (Fruton ja Bergmann 1942). Jacobsen tunnisti pian lisää kymotrypsiinin muotoja ja nimesi ne delta- ja pi-muodoiksi (Jacobsen 1947). Vuonna 1948 Schwert karakterisoi edelleen kymotrypsiinin ja kymotrypsinogeenin molekyylipainoja.

Vuonna 1954 Hartley ja Kilby raportoivat ensimmäiset todisteet kolmivaiheisesta mekanismista, jolla kymotrypsiini hydrolysoi amidi- ja esterisubstraatteja, ja he esittivät hypoteesin asyylientsyymin välituotteen läsnäolosta, mikä myöhemmin osoittautui todeksi (Henderson 1970). Vuonna 1955 Laskowski sai toisen kiteisen kymotrypsiinigeenin ja nimesi sen kymotrypsiinigeeni B:ksi. Vuonna 1964 Hartley määritti kymotrypsiini A:n aminohapposekvenssin, jonka Meloun ym. tarkensivat myöhemmin vuonna 1966. Vuonna 1968 Smillie et al. määrittivät kymotrypsiini B:n aminohapposekvenssin, joka oli 80-prosenttisesti identtinen kymotrypsiini A:n kanssa. 1970- ja 1980-luvuilla tehtiin tutkimuksia, joilla pyrittiin ymmärtämään paremmin toimintamekanismia ja tunnistamaan trypsiinin ja kymotrypsiinin aminohapposekvenssien välisiä eroja (Steitz et al., ). 1969, Cohen ym. 1981, Asbóth ja Polgár 1983 sekä Gráf ym. 1988).

Kymotrypsiiniä puhdistettiin 1990-luvulla muista lähteistä, kuten Atlantin turskasta (Ásgeirsson ja Bjarnason 1991) ja kamelista (Al-Ajlan ja Bailey 1997). Lisäksi alettiin tutkia inhibiittoreita (Baek ym. 1990), ja Frigerio ym. selvittivät naudan kymotrypsiinin kiderakenteen 2,0 Å:n resoluutioon (Frigerio ym. 1992).

Uudemmissa tutkimuksissa on selvitetty kymotrypsiinin taittumista ja denaturoitumista eri pitoisuuksissa (Ghaouar ym. 2010), kymotrypsiinin vuorovaikutusta nanohiukkasten substraattien kanssa (You et al. 2006 ja Jordan ym. 2009) ja kymotrypsiinin vakauden lisääminen konjugoimalla PEG-molekyyleihin (Castellanos ym. 2005 ja Rodríguez-Martínez ym. 2009).

Spesifisyys:

Kymotrypsiini aktivoituu, kun trypsiini pilkkoo arginiinin ja isoleusiinin (R15 ja I16) välisen sidoksen aiheuttaen rakenteellisia modifikaatioita ja muodostamalla substraatin sitoutumiskohdan (Sears 2010). Kymotrypsiini eroaa trypsiinistä siinä, että trypsiini pilkkoo peptidejä arginiini- ja lysiinijäämien kohdalta, kun taas kymotrypsiini suosii suuria hydrofobisia jäämiä (Hedstrom ym. 1992). Kymotrypsiini katalysoi mieluiten sellaisten peptidisidosten hydrolyysiä, joihin liittyy tyrosiinin, fenyylialaniinin ja tryptofaanin L-isomeerejä. Se vaikuttaa helposti myös herkkien aminohappojen amideihin ja estereihin. Kymotrypsiinin spesifisyys suurille hydrofobisille jäännöksille voidaan selittää hydrofobisella S1-sidontatasolla, jonka muodostavat jäännökset 189-195, 214-220 ja 225-228 (Cohen ym. 1981).

Vaikka trypsiinin ja kymotrypsiinin S1-kohdan rakenteessa on vain yksi ero (asennossa 189), trypsiinin ja kymotrypsiinin kohdekohtaisella mutageneesillä ei ole onnistuttu vaihtamaan spesifisyyksiä keskenään, mikä viittaa siihen, että mekanismia, jolla trypsiini ja kymotrypsiini saavuttavat substraattispesifisen katalyysin, ei ole täysin ymmärretty (Steitz ym. 1969 ja Gráf ym. 1988).

Molekyyliominaisuudet:

Kymotrypsiini A:lla ja B:llä on 80 prosentin sekvenssi-identiteetti (Hartley 1964, Meloun ym. 1966, Smillie ym. 1968 ja Gráf ym. 2004). Katalyyttisen triadin aminohapot (H57, D102 ja S195) ovat erittäin konservoituneita S1-perheen peptidaasien sekvensseissä (Gráf ym. 2004). Asemassa 214 oleva seriini on myös erittäin konservoitunut perheessä, ja sitä on ehdotettu katalyyttisen triadin neljänneksi jäseneksi (Ohara ym. 1989 ja McGrath ym. 1992).

Kompositio:

Katalyyttisen triadin kolme aminohappojäännöstä (H57, D102 ja S195) ovat välttämättömiä peptidisidosten pilkkomiselle, ja ne ovat vetysidosten stabiloimia (Sears 2010 ja Gráf ym. 2004). G193 ja S195 muodostavat oksianionireiän ja ovat vuorovaikutuksessa skissile-peptidisidoksen karbonyyliryhmän kanssa suuntaamalla sitä tetraedrisen välituotteen muodostamiseksi (Rühlmann ym. 1973, Huber ja Bode 1978 sekä Gráf ym. 2004).

Proteiini Accession Number: P00766

CATH-luokitus (v. 3.3.0):

• Luokka:
  • Luokka: P00766

    CATH-luokitus (v. 3.3.0): Pääasiassa Beta

  • Arkkitehtuuri: Beta Barrel
  • Topologia: Trypsiinin kaltainen seriiniproteaasi

  Molekyylipaino:

  • 25,6 kDa (Wilcox 1970)

  Optimaalinen pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

  Isoelektrinen piste:

  • 8.52 (kymotrypsinogeeni, teoreettinen)
  • 8.33 (kymotrypsiini, teoreettinen)

  Extinktiokerroin:

  • 51,840 cm-1 M-1 (teoreettinen)
  • E1%,280 = 20.19 (Kymotrypsinogeeni, teoreettinen)
  • E1%,280 = 20.57 (Kymotrypsiini, teoreettinen)

  Active Site Residues:

  • Histidiini (H57)
  • Aspartaatti (D102)
  • Seriini (S195)

  Aktivaattorit:

  • Cetyylitributyyliammoniumbromidi (Spreti et al. 2008)
  • Dodekyylitrimetyyliammoniumbromidi (Abuin et al. 2005)
  • Heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidi (Celej et al. 2004)
  • Tetrabutyyliammoniumbromidi (Spreti et al. 2001)

  Inhibiittorit:

  • Hydroksimetyylipyrrolit (Abell ja Nabbs 2001)
  • Boorihapot (Smoum ym. 2003)
  • Kourmariinijohdannaiset (Pochet ym. 2000)
  • Peptidyylialdehydit (Lesner ym. 2009)
  • Peptidit luonnollisista lähteistä (Telang ym. 2009, Roussel ym. 2001 ja Chopin ym. 2000)
  • Peptidit, jotka sisältävät luonnotonta aminohappoa (Legowska ym. 2009 ja Wysocka ym. 2008)

  Sovellukset:

  • Sekvenssianalyysi
  • Peptidisynteesi
  • Peptidikartoitus
  • Peptidien sormenjälkitutkimus