Abstract
Tässä työssä esitetään yksityiskohtainen kuvaus eteläamerikkalaisen monnin Rhamdia quelen haiman saarekkeiden erittävien solujen ultrastruktuurista. Esitetään todisteita sen väitteen tueksi, että α-granulat koostuvat keskimmäisestä ja ulommasta osasta, joilla on erilaiset elektronitiheydet ja liukoisuudet, että δ-solut ovat mitä todennäköisimmin morfologisesti muuttuneita, mutta elinkelpoisia α-soluja ja että β-granuloilla on mahdollisesti toistuva alusrakenne ja että ne voivat siten edustaa solunsisäistä kiteistä insuliinin varastointimuotoa.
1. Johdanto
Langerhansin saarekkeet löysi Langerhans kanista vuonna 1869. Stannius ja Blockmann raportoivat niistä kuitenkin noin 20 vuotta aikaisemmin teleostereissa, ja siksi niistä käytetään myös, vaikkakin harvemmin, nimitystä Stanniuksen tai Blockmannin elimet. Langerhansin saarekkeet ovat endodermista alkuperää, ja useimmilla teleostereoilla ne ovat pieniä, haiman eksokriiniseen osaan hajallaan olevia elimiä.
Kalalla ei ole erillistä haimaa. Eksokriinistä haimakudosta voi löytyä hajallaan pitkin suolistoreittiä. Eksokriinisen haiman akinaarinen rakenne on hyvin samankaltainen kuin nisäkkäillä, ja se koostuu soluista, joissa on hyvin tumma, basofiilinen sytoplasma . Aktiivisesti ruokailevilla kaloilla niissä on suuri määrä kirkkaita eosinofiilisiä, erittäviä rakkuloita. Endokriininen haiman Langerhansin saareke voidaan erottaa, ja kudokseen kuuluu α-soluja (jotka tuottavat glukagonin kaltaista peptidiä), β-soluja (jotka tuottavat insuliinia) ja d-soluja (jotka tuottavat somatostatiinia) . Nisäkkäillä ja ihmisillä useimmat aikaisemmat elektronimikroskooppiset kuvaukset aikuisen ihmisen haiman saarekkeista ovat olleet lyhyitä, ja vähäiset osat julkaisuista on omistettu ensisijaisesti β-solukasvainten kuvauksille tai katsausartikkeleille, joissa käsitellään useiden lajien saarekkeiden vertailevaa morfologiaa.
Kalojen haima ei useinkaan osoittautuisi valmiiksi kudoslähteeksi elektronimikroskooppista tutkimusta varten. Kalan päähaima muistuttaa sekä anatomisesti että kehityksellisesti nisäkkäiden haimaa, kun taas muissa kalalajeissa on huomattavia eroja. Aikuisen seeprakalan päähaimassa on useita pääsaarekkeita, joita ympäröi eksokriininen kudos. Yksittäisistä saarekkeista koostuva, eksokriinisen kudoksen ja rasvan ympäröimä pyrstö ulottuu kaudaalisesti suolistoa pitkin. Sen sijaan tilapian (toinen glukoosille herkkä teleostikala) β-solut sijaitsevat Langerhansin saarekkeissa, jotka sijaitsevat suoliliepeessä ja joita ei ympäröi eksokriininen kudos. Rhamdia quelen on teleostilaji ja tärkeä laji vesiviljelyssä subtrooppisessa ilmastossa. R. queleniä tavataan Etelä-Meksikosta Keski-Argentiinaan, ja tämän lajin kasvatus on leviämässä kohti Etelä-Brasiliaa .
Tässä tutkimuksessa analysoimme Langerhansin saarekkeiden ultrastruktuuria ja kuvaamme yksityiskohtaisesti erityissolujen eri tyypit eteläamerikkalaisessa monnissa R. quelenissä. quelen.
2. Materiaalit ja menetelmät
Neljä viljeltyä R. quelemiä kaksi naarasta ja kaksi urosta ( g; cm) Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) -laitokselta Koillis-Argentiinasta, ja ne istutettiin 200 L:n altaisiin, joissa niitä akklimatisoitiin kahden viikon ajan ennen ruumiinavausta. Kaloja kasvatettiin suodatetulla makealla vedellä, jota pidettiin 25 °C:ssa ja jonka vedenvaihtuvuus oli 100 % päivässä. Valojakso oli säädetty siten, että pimeää oli 12 tuntia ja valoisaa 12 tuntia. Niitä ruokittiin käsin neljä kertaa päivässä kaupallisella ruokavaliolla (Ganave). Kalat lopetettiin bentsokaiinilla (500 ppm) ja nekropsioitiin, ja näytteet rasvasta, joka ulottuu kaudaalisesti suolta pitkin, kiinnitettiin 10-prosenttiseen puskuroituun formaliiniin, upotettiin parafiiniin ja värjättiin hematoksyliini- ja eosiinivärjäyksellä (H&E).
Pienet kudosfragmentit leikattiin 1 mm:n lohkoiksi ja kiinnitettiin välittömästi fosfaattipuskuroituun glutaraldehydiin (pH 6.9 4 °C:ssa), pestiin Millonigin liuoksella ja jälkikiinnitettiin 1 %:ssa osmiumtetroksidissa; kudoslohkot dehydratoitiin sen jälkeen etanoli-asetonisarjassa, upotettiin propyleenioksidiin ja upotettiin Durcupan ACNI:hen (Fluka Chemie A.G., Sveitsi). Ohuet leikkeet leikattiin LKB-ultramikrotomilla ja värjättiin kahdesti uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla ennen tutkimista Jeol JEM-8T -elektronimikroskoopilla (Jeol, Tokio, Japani).
3. Tulokset
3.1. Elektronimikroskooppi. Valomikroskopia
R. quelenin haimat ovat hajallaan yhteistä sappitietä ympäröivässä rasvakudoksessa; tämä sijaitsee karkeasti kolmiomaisella alueella, jota hahmottelee ylempänä mahalaukku, etupuolella maksa ja alempana perna ja sappirakko. Jokainen Langerhansin saareke koostuu suhteellisen puhtaasta saarekekudoksesta, jota ympäröi eksokriininen haima (kuva 1). Miesten ja naisten välillä ei havaittu eroja.
3.2. H&E. X 10). Elektronimikroskooppi
β-solut, jotka tavallisesti sijaitsevat saarekkeiden sisäosissa, erotettiin yleisesti, mutta ei aina, eksokriinisestä haimasta perifeerisesti sijaitsevien α-solujen avulla (kuva 2). β-solujen ultrastruktuurinen ulkonäkö oli identtinen neljästä kalasta saaduissa näytteissä. Erottuvat β-granulat olivat sileäkalvoisissa pusseissa, ja niiden koko ja muoto vaihtelivat. Näkyvissä oli suorakulmaisia, neliömäisiä, kuusikulmaisia ja epäsäännöllisen monikulmaisia kiteitä. Pyöreitä muotoja esiintyi, mutta harvemmin (kuvat 2-5). Kukin rake koostui yhdestä tai useammasta kiteisestä tai rakenteettomasta muodosta, joiden koko ja muoto vaihteli. Fiksatiivin valinta ei näyttänyt vaikuttavan β-rakeiden sisäiseen rakenteeseen. Kiteitä ympäröivän kalvon sisällä kiteiden reuna-alueet näyttivät tyhjiltä tai sisälsivät hienojakoista flokkulaarista sakkaa käytetystä fiksatiivista riippumatta. Suuremmilla suurennoksilla toistuva alusrakenne näkyi joskus niissä kiteissä, jotka olivat oikein suuntautuneet leikkaustasoon nähden (kuvat 6 ja 7). Lukuisat mitokondriot olivat hajallaan koko solussa, ja ne näkyivät pyöreinä tai pulleina säiemäisinä rakenteina. Ne olivat suurempia ja lukuisampia kuin β-solun solut, mutta yleensä pienempiä kuin haiman acinarisolujen solut. Lukuisat mitokondrioiden kristat olivat suurimmaksi osaksi suuntautuneet poikittaissuunnassa, ja mitokondriorakeet olivat läsnä, mutta ne eivät olleet näkyviä. Granulaarisen endoplasmisen retikulumin sisäkkeet olivat yleensä lyhyitä tai rakkulamaisia (kuvat 2-4). Granulaarinen endoplasminen retikulum ja vapaat ribosomit eivät olleet yhtä selväpiirteisiä piirteitä β-soluissa kuin akinaari- tai β-soluissa. Haiman acinaari- (AC), α- (A) ja β- (B) solut näkyvät erottuvine rakeineen. α-granulaattien tiheän sisemmän ytimen ja vähemmän tiheän ulkovaipan sekä laajentuneiden Golgi-rakenteiden (G) säilyminen. α-soluissa on seroidirakeita (kaarevat nuolet). Huomaa sentriolit (suorat nuolet). M: mitokondrio. X 9500.
Golgi-kompleksi oli näkyvämpi aldehydifiksoinnin jälkeen ja komponenttirakenteet olivat laajentuneempia (kuva 2). Näiden fiksatiivien käytön jälkeen Golgin vesikkelien sisällä näkyi ajoittain tiheää amorfista materiaalia, joka saattaa edustaa epäkypsiä rakkuloita tai β-sekretoristen rakkuloiden esiasteita. β-solujen tumat olivat tavallisesti pallomaisia ja suhteellisen sileäpiirteisiä. Vierekkäisten saarekesolujen solukalvot olivat tiiviisti kiinni desmosomeissa, vaikkakaan eivät useinkaan liittyneet niihin. Kolmen tai useamman solun yhtymäkohdassa rajakalvot olivat usein mutkittelevia, ja solujen väliset liitokset olivat mutkittelevia (kuvat 2 ja 9). Useimmissa β-soluissa oli silmiinpistäviä keroidia muistuttavia monisoluisia sytoplasmisulkeumia (kuvat 2, 7, 9 ja 8). Osmiinihapon tai aldehydin ensisijainen käyttö kiinnitysaineena ei vaikuttanut tuntuvasti näiden sulkeumien esiintymiseen ja esiintymistiheyteen, eikä näiden rakeiden esiintymisen ja solujen fysiologisen toiminnan morfologisten todisteiden välillä ollut ilmeistä yhteyttä. α-solujen ultrastruktuuri oli sama kaikissa neljässä kudosnäytteessä. Näiden solujen ja niiden tuman koko ja muoto eivät eronneet merkittävästi normaaleista β-soluista (kuvat 2 ja 7). Vaikka joskus havaittiin α-soluja, joiden tuma oli epäsäännöllisen muotoinen tai painautunut, tätä ei esiintynyt niin usein, että se olisi käyttökelpoinen erottelukriteeri. α-solujen sytoplasmagranulaatit säilyivät primaarisessa osmium-fiksaatiossa tiheinä, pallomaisina ja vaihtelevan kokoisina kappaleina, ja ne sijaitsivat löyhästi istuvissa sileäkalvoisissa pusseissa (kuvat 7 ja 9). Ne olivat suurempia kuin β-granulat, mutta huomattavasti pienempiä kuin acinarisolujen zymogeenirakeet (kuva 2). Hoikkia, pitkänomaisia mitokondrioita oli kohtalainen määrä ja ne olivat pienempiä kuin β-solujen mitokondriot, ja niissä oli tavallisesti poikittaissuuntaiset cristae-kohdat. Rakeinen endoplasminen retikulum oli usein sisäkkäinen ja runsaampi kuin β-soluissa (kuva 9). Golgi-kompleksi, silloin kun se oli näkyvissä, oli kohtalaisen suuri. Golgin vesikkelien ja cisternojen sisällä olevat tiheät amorfiset aineet, jotka ovat oletettavasti erittävien granuloiden esiasteita, olivat yleisempiä α-soluissa kuin β-soluissa (kuva 10). Seroidikappaleet olivat usein näkyvissä, mutta niitä oli vähemmän kuin β-soluissa (kuvat 2 ja 3). Pussit, joissa α-granulaatit sijaitsevat, näyttivät siis olevan täysin täynnä, ja pääteltiin, että granulaatit koostuvat pyöristyneestä sisäisestä tiheästä ytimestä ja ulommasta vähemmän elektronitiheästä vaipasta, joka puuttui osmiumin kiinnittämisen jälkeen (kuvat 3 ja 9) ja oli siten ehkä liukoisempi. α-rakeiden sisä- tai reunaosissa ei näkynyt johdonmukaista alarakennetta. Missään vaiheessa ei näkynyt soluja, jotka voitaisiin tulkita α-solujen ja β-solujen väliseksi siirtymämuodoksi. α-granulaatiot, mukaan lukien sekä ulompi että sisempi tiheämpi osa, olivat kokonaiskooltaan verrattavissa ”δ-granulaatioihin”. Lisäksi esiintyy välikappalesoluja, jotka sisälsivät molempien tyyppien granuloita, mikä viittaa siihen, että δ-solut olivat itse asiassa muunneltuja α-soluja (kuva 10). δ-solut visualisoitiin, vaikka ne sijaitsivat lähes aina α-solujen joukossa, ja ne on tunnistettu ja erotettu ultrastruktuurisesti α-soluista niiden pienemmän elektronitiheyden ja erittävien granuloiden suuremman kokonaiskoon perusteella. Lisäksi esiintyy välikappalesoluja, jotka sisälsivät molempien tyyppien granuloita, mikä viittaa siihen, että δ-solut olivat itse asiassa muunneltuja α-soluja (kuva 11).
Vaikka erittyvien granuloiden lukumäärän ja Golgi-kompleksin ja granulaarisen endoplasmisen retikulumin näkyvyyden välillä oli käänteinen suhde, ei havaittu α- tai β-granuloiden vapautumisen mallia. Ohut tyvikalvo ja vaihteleva määrä sidekudosta erotti yleensä haiman saarekkeet viereisistä acinarisoluista (kuva 2). Toisinaan saarekkeiden ja acinussolujen välissä ei kuitenkaan ollut lainkaan tyvikalvoa, jolloin niitä erotti toisistaan vain kapea interstitiaalinen tila. Kapillaarien endoteelisoluja erotti niistä aina vähintään kapillaarien tyvikalvo (kuva 9). Myös muita tukielementtejä, kuten kollageeni- ja elastisen kudoksen komponentteja, oli joskus läsnä. Urosten ja naaraiden välillä ei havaittu eroja.
4. Keskustelu
Kalojen β-solut erottuvat helposti α-soluista erittävien granuloiden morfologian perusteella. Kulmikkaiden alayksiköiden tiheä esiintyminen ja ilmeinen toistuva alarakenne viittaavat β-granulaattien kiteiseen luonteeseen. Yritykset ratkaista ja mitata kideruudukon mitat eivät ole vielä onnistuneet. Kun sekretorisia granuloita visualisoitiin Golgi-kompleksin läheisyydessä, kiteisiä alayksiköitä ei yleensä havaittu. Siksi on houkuttelevaa spekuloida, että ei-kiteiset rakeet tai Golgi-kompleksin sisällä oleva amorfinen materiaali edustaa insuliinin tai insuliiniproteiinikompleksin erilaista kemiallista tai fysikaalista muotoa kuin rakeen kiteiset alayksiköt. Ei tiedetä, onko näillä β-rakeiden sisällä olevilla erilaisilla morfologisilla muodoilla erilaiset liukoisuudet ja kenties erilaiset vapautumismallit tai -tahot vastauksena fysiologiseen kysyntään. Erittyviä granuloita ei havaittu granulaarisen endoplasmisen retikulumin sisternoissa tai vesikkeleissä. Oletetaan, että muiden proteiineja erittävien solujen tapaan Golgin kompleksi keskittää tai ”pakkaa” granulaarisessa endoplasmisessa retikulumissa syntetisoidun tuotteen. Tästä seuraisi loogisesti, että sileäkalvoiset pussit, joissa erittyvät rakeet ovat, ovat peräisin Golgin kalvoista eivätkä granulaarisesta endoplasmisesta retikulumista.
A-solut suurine, pyöreine, tiheine erittyvine rakeineen ovat melko samanlaisia kuin muiden lajien α-solut. Vaikka α-solujen granuloiden koko vaihtelee suuresti, useimmilla soluilla näytti olevan valikoima erikokoisia granuloita, mikä estää tämän solutyypin alaluokittelun, kuten on ehdotettu muiden lajien osalta. Tällä hetkellä ei ole julkaistu fysiologisia tietoja, jotka tukisivat ”δ-solun” olemassaoloa kalojen haiman saarekkeessa. Eri tutkijat ovat tukeneet δ-solujen olemassaoloa tiedoilla, jotka perustuvat valomikroskooppisiin tutkimuksiin kapriisihopea-, fosforihappo-hematoksyliini- ja muista rakeiden värjäyksistä tai elektronimikroskooppisiin tutkimuksiin huonosti säilyneistä kudoksista. Tässä esitetyt mikrokuvat tukevat Bloomin vuonna 1931 ja sittemmin Gomorin vuonna 1941 esittämää näkemystä, jonka mukaan δ-solut saattavat edustaa muuntuneita α-soluja.
Tyypillisestä α-granulaatiosta, jossa on sisempi tiheä ja ulompi vähemmän tiheä osa, siirryttäessä suunnilleen samankokoiseen δ-granulaatioon, jossa on tasainen mutta vähentynyt tiheys, seuraa usein mitokondrioiden, Golgin kompleksin ja granulaarisen endoplasmaverkoston kalvokomponenttien morfologisen eheyden tai värjäytymisintensiteetin asteittainen heikkeneminen. Ehjät ja elinkelpoisilta näyttävät tumat sekä pienten vapaana olevien ribosomien ja seroidirunkojen säilyminen viittaavat siihen, että niin sanotut δ-solut ovat elinkelpoisia jopa tämän siirtymän oletetussa loppuvaiheessa, eli kun erittyvät granulukset eivät ole enää näkyvissä ja kaikki muut sytoplasman organellit kuin seroidirakenteet ja ribosomit ovat poissa. Fysiologisten tietojen puuttuessa, jotka osoittaisivat δ-soluille toiminnon, ja koska ei ole olemassa vakuuttavampia morfologisia todisteita erillisestä solutyypistä, on toivottavaa, että tässä esitelty todennäköinen siirtymä α-soluista δ-soluihin hyväksytään todennäköisimmäksi selitykseksi ihmisen kolmannelle Bloomin granulaariselle solulle. Näiden elinkelpoisten mutta muuttuneiden α-solujen merkitystä ei tunneta. Vaikka α- ja β-soluja voi esiintyä yksittäin tai pieninä ryhminä acini- ja ductus-soluissa, yhdessäkään tutkituista neljästä haimanäytteestä ei missään vaiheessa havaittu acinaari- ja saarekesolujen tai ductus- ja saarekesolujen välisiä välimuotoja, kuten Nakamura ja Yokote olivat ehdottaneet (4).
Interressiristiriita
Tekijät ilmoittavat, että tämän artikkelin julkaisemiseen ei liity eturistiriitoja.
Kiitos
L. A. Romano on saanut tuottavuustutkimusapurahan Brasilian tutkimusneuvostolta CNPq:ltä (prosessi nro PQ 301002/2012-6).