Abstract
Tausta. Amyloidoosi on solunulkoinen, itsestään peräisin olevan eosinofiilisen hyaliinimaisen materiaalin saostuma, jolla on erityisiä värjäytymisominaisuuksia ja fibrillaarinen ultrastruktuuri. Makulaarinen amyloidoosi rajoittuu ihoon, ja sen patogeneesiin on ehdotettu useita tekijöitä. Epstein-Barr-viruksen (EBV) DNA:n havaitseminen tässä leesiossa viittaa siihen, että tällä viruksella voi olla merkitystä tämän taudin patogeneesissä. Tavoite. EBV-DNA:n osoittaminen tehtiin 30:stä ihonäytteestä, joissa oli diagnosoitu makulaarinen amyloidoosi, ja 31:stä terveestä ihonäytteestä poistettujen melanosyyttisten nevojen marginaalissa PCR:n avulla. Tulokset. PCR:llä beeta-globiinigeenin suhteen positiivisilla potilailla EBV-viruksen BLLF1-geeni oli positiivinen 23 potilaalla (8 potilasta tapaus- ja 15 potilasta kontrolliryhmässä). EBV-DNA:n esiintymisessä ei ollut merkittävää eroa makulaarisen amyloidoosin (3,8 %) ja kontrolliryhmän (23,8 %) välillä (). Päätelmät. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että EBV ei osallistu makulaarisen amyloidoosin patogeneesiin.
1. Johdanto
Amyloidoosi on kuituproteiinien ryhmän solunulkoinen kerrostuma. Amyloidoosin luokitteluun on erilaisia lähestymistapoja, mutta yksinkertaisin menetelmä on jako systeemiseen ja elinkohtaiseen (paikalliseen) tyyppiin. Iho on osallisena kudoksena molemmissa tyypeissä. Ihoon paikallisesti rajoittuvaa amyloidoosia on kahta tyyppiä: (i) keratiininen, joka voi olla primaarinen tai sekundaarinen, ja ii) nodulaarinen. Sekundaarinen tyyppi on sekundaarinen muiden ihomuutosten, kuten ihokasvainten, tulehduksellisten ihosairauksien ja valohoidon seurauksena. Keratoottista amyloidoosia on tunnistettu kaksi tyyppiä: makulaarinen ja jäkäläinen amyloidoosi, joista jälkimmäinen on yleisempi. Keratoottisessa amyloidoosissa tyvikeratinosyytistä peräisin olevat keratiinikerrostumat ovat pääasiassa CK5-positiivisia. Keratoottista tyyppiä havaitaan lähinnä Kaakkois-Aasiassa, Etelä-Amerikassa ja Kiinassa. Sillä on familiaalinen (10 %) ja sporadinen muoto, ja jälkimmäinen on yleisempi naisilla . Yleisimmät sairastumispaikat ovat yläselkä (interskapulaarinen alue) ja raajat (sääret ja käsivarret), mutta niitä on kuvattu myös kasvoissa, vartalossa ja reisissä . Makulaarisen amyloidoosin vauriot esiintyvät tavallisesti hyperpigmentoituneina laikkuina, joilla on epämääräiset marginaalit ja jotka koostuvat harmahtavan ruskeista makuloista, jotka usein näyttävät verkkomaisilta tai aaltoilevilta (kuva 1). Kutina on yleinen oire ennen amyloidoosin puhkeamista .
Tämän sairauden patogeneesi ei ole täysin selvitetty lukuun ottamatta sitä, että laskeutunut keratiini on peräisin keratinosyyteistä . On ehdotettu kahta patogeneettistä mekanismia, mukaan lukien apoptoottinen (fibrillaarinen) teoria ja sekretorinen teoria . Apoptoottisen teorian mukaan vaurioituneiden keratinosyyttien rappeutumista tyvikerroksessa seuraa näiden kolloidikappaleiden muuttuminen dermaalisten histiosyyttien ja fibroblastien toimesta amyloidiksi papillaarisessa dermiksessä (kuva 2). Erittävän teorian mukaan degeneroituneista tyvikeratinosyyteistä peräisin olevat amyloidikerrostumat leviävät vaurioituneen lamina densan kautta papillaariseen dermikseen. Makulaarisen amyloidoosin patogeneesiin on yhdistetty useita etiologisia tekijöitä: rotutekijät , geneettinen alttius, ympäristötekijät , sukupuoli (nainen) , naishormonit , altistuminen auringonvalolle , kitka (pitkäaikainen hankaus) , atopia , autoimmuniteetti (perustuu yhteyteen systeemisen lupus erythematosuksen, dermatomyosiitin, systeemisen skleroosin, sarkoidoosin ja IgA-nefropatian kanssa) ja EBV-infektio . EBV, jonka esiintymistä on raportoitu makulaarisen amyloidoosin epidermiksessä, toimii todennäköisesti keratinosyyttien rappeutumista edistävänä tekijänä .
EbV:n roolia primaarisen ihon amyloidoosin etiopatogeneesissä on arvioitu vain kahdessa aiemmassa tutkimuksessa, mukaan lukien yksittäinen tapausraportti ja 27 potilaan tapaussarja Kiinasta . Ottaen huomioon EBV:n ja makulaarisen amyloidoosin välistä yhteyttä koskevien tutkimusten puutteen, ryhdyimme suorittamaan asiaa koskevan tutkimuksen Iranissa. Ehkä tulevaisuudessa voidaan käyttää antiviraalisia aineita tämän taudin hoitoon, jos kyseessä on assosiaatio EBV: n kanssa.
2. Materiaalit ja menetelmät
Tässä tapaus-verrokkitutkimuksessa 38 makulaarista amyloidoosinäytettä ja 38 tervettä ihonäytettä, jotka olivat peräisin iän ja sukupuolen suhteen yhteensopivilta potilailta, joilla ei ollut makulaarista amyloidoosia, ja 38 tervettä ihonäytettä, jotka olivat peräisin iältään ja sukupuoleltaan yhteensopivien potilaiden, joilla ei ollut makulaarista amyloidoosia, ympäriltä, otettiin mukaan kliiniseen tutkimukseen, jonka perustana oli ei-tunnistettu objektiivisesti suuntautunut otanta. Sisäänottokriteereihin kuuluivat Mashhadissa sijaitsevan Imam Reza -sairaalan patologian osaston arkistoissa olevat parafiinilohkot, joissa oli riittävästi kudosta ja joissa oli diagnosoitu makulaarinen amyloidoosi patologisen raportin ja kliinisen esityksen perusteella. Poissulkukriteereihin kuuluivat lohkot, joiden arkistotiedot olivat puutteelliset, ja riittämättömät näytteet PCR:ää varten.
Tapausryhmässä amyloidikerrostuma vahvistettiin optisella mikroskoopialla ja Kongon punavärjäyksellä. Seuraavassa vaiheessa kustakin tapaus- ja kontrolliryhmän lohkosta valmistettiin kuusi 5 μm:n leikettä steriileissä olosuhteissa käyttäen steriiliä terää, ja ne sijoitettiin steriileihin Eppendorf-putkiin.
2.1. Tapaukset Deparaffinointi
Parafinoitujen kudosten deparafinointiin käytettiin ksylolia/etanolia. Yksi millilitra ksylolia lisättiin kudosleikkeitä sisältäviin mikroputkiin ja inkuboitiin huoneenlämmössä puoli tuntia jatkuvasti ravistellen. Seuraavassa vaiheessa mikroputkia sentrifugoitiin 13 000 rpm 10 minuutin ajan ja niiden supernatantti hävitettiin. Nämä kaksi vaihetta toistettiin kerran. Sakkaan lisättiin viisisataa μl 100-prosenttista etanolia ja sentrifugoitiin 10 m 13 000 rpm:ssä useiden mikroputkien kääntelemisten jälkeen, minkä jälkeen supernatantti poistettiin. Tämä vaihe toistettiin uudelleen. Lopuksi saatu sakka asetettiin huoneenlämpöön, jotta etanoli haihtui kokonaan, mutta ei sakkaa.
2.2. DNA:n uuttaminen
DNA:n uuttamiseen käytettiin BIO BASIC INC:n (Kanada) kittiä, jonka eränumero on 8401-140116. Uuttamiseen käytettiin lyysipuskuri-T:tä. Seuraavassa vaiheessa 100 μl uuttopuskuria ja 10 μl proteinaasi K:ta lisättiin kuhunkin mikroputkeen ja sekoitettiin. Kudosnäytteet lisättiin seokseen ja inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuuttia. Sitten näytteitä inkuboitiin 95 °C:ssa 3 minuuttia proteinaasi K:n inaktivoimiseksi. 100 μL Universal Buffer NST:tä lisättiin putkiin ja käännettiin 10 kertaa. Saatua seosta käytettiin PCR:ään.
2.3. PCR
Tässä tutkimuksessa käytettiin PCR:ää EBV-genomin havaitsemiseksi makulaarisessa amyloidoosissa. Sen jälkeen kun DNA oli uutettu parafinoituneista lohkoista, parafiiniin upotetuista kudoksista uutetun DNA:n laatu määritettiin käyttämällä beeta-globiinigeenin alukkeita. Tässä tutkimuksessa käytetyt GH20- ja PC04-beta-globiinigeenin alukkeet monistivat 260 bp:n fragmentin. Näiden alukkeiden sekvenssi oli seuraava: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.Näytteitä, jotka tuottivat 260 bp:n fragmentin halutuilla alukkeilla, pidettiin suotuisina EBV-viruksen BLLF1-geenin monistamiselle.
Ebv-sekvenssin esiintyminen uutetuissa DNA-näytteissä testattiin Cinna Gen -kitillä, jonka eränumero oli 935701 (Sina Clon, Iran). Tämä kitti on suunniteltu määrittämään EBV-DNA:n laatu tartunnan saaneissa näytteissä PCR:n avulla. Sekoittamiseen käytettiin optimoitua 1x PCR-reagenssia seoksena, jossa oli rekombinantti Taq DNA-polymeraasia, PCR-puskuria, MgCl2:ta, dNTP:tä ja alukkeita. Alukkeilla monistettiin gp 350/220:tä koodaavan BLLF1-geenin erittäin spesifinen ja toistuva alue. Niillä voidaan havaita vähintään 30 EBV-kopiota. 239 bp:n tai 256 bp:n fragmenttien esiintyminen merkitsee positiivista testitulosta.
Tietojen analysointi suoritettiin SPSS 11.5 -ohjelmistolla. Tietojen kuvaamiseen käytettiin kaavioita ja tilastollisia taulukoita, ja Khiin neliö- ja riippumaton -testejä käytettiin EBV:n vertailuun terveiden ja potilaiden näytteissä. Kaikissa testeissä pidettiin merkitsevyystasona 0,05.
3. Tulokset
Potilaista 50 prosenttia oli miehiä (19/38) ja 50 prosenttia naisia (19/38). Kolme potilasta kuului ikäryhmään alle 20 vuotta (7,9 %), 5 potilasta 20-30 vuotta (13,2 %), 10 potilasta 30-40 vuotta (26,3 %), 13 potilasta 40-50 vuotta (34,2 %), 4 potilasta 50-60 vuotta (10,5 %) ja 3 potilasta yli 60 vuotta (7,9 %). Pienin ikä oli 19 vuotta ja suurin ikä 76 vuotta. Infektioita oli 27 tapauksessa vartalossa (71,1 %) ja 11 tapauksessa raajoissa (28,9 %). Tutkimus- ja kontrolliryhmä vastasivat toisiaan iän () ja sukupuolen () suhteen. 76 näytteestä (38 tapausta ja 38 kontrolliryhmää) tehtiin beetaglobiinigeenin PCR, joka oli positiivinen 61 näytteessä (30 näytettä tapausryhmässä ja 31 näytettä kontrolliryhmässä) ja negatiivinen 15 näytteessä (8 näytettä tapausryhmässä ja 7 näytettä kontrolliryhmässä) (kuva 3).
PCR:llä beetaglobiinigeenin suhteen positiivisissa 61 näytteessä EBV:n BLLF1-geeni oli positiivinen 23:ssa näytteessä (8:ssa näytteessä tutkimusryhmässä ja 15:ssä näytteessä kontrolliryhmässä) ja negatiivinen 38:ssa näytteessä (22:ssä näytteessä tutkimusryhmässä ja 16:ssä näytteessä kontrolliryhmässä) (kuva 4).
Ebv:n BLLF1-geenin PCR-testaus oli 26,7 % positiivinen tutkimusryhmässä ja 48,4 % positiivinen kontrolliryhmässä. Khiin neliö -testin tulokset eivät osoittaneet korrelaatiota EBV:n ja makulaarisen amyloidoosin välillä () (taulukko 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Keskustelu
Amyloidoosi tunnetaan solunulkoisena eosinofiilisen hyaliinimaisen materiaalin laskeumana, jolla on omaa alkuperää ja jolla on spesifiset värjäytymis- ja ultrastruktuuriset ominaisuudet. Tämä häiriö voi esiintyä systeemisten sairauksien taustalla tai rajoittua ihoon. Makulaarinen amyloidoosi rajoittuu ihoon . EBV voi stimuloida keratinosyyttien amyloidimateriaalin eritystä tai se voi stimuloida keratinosyyttien rappeutumista ja rappeutuneiden keratinosyyttifilamenttien muuttumista amyloidiksi . Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet epiteelisolujen roolin EBV:n jatkuvassa lisääntymisessä. EBV:n solupintareseptorit, joita on löydetty vähemmän erilaistuneesta levyepiteelistä, viittaavat epidermiksen keratinosyyttien suoraan infektioon. Infektio voi tapahtua itämiskerroksissa; viruksen lisääntyminen on kuitenkin mahdollista vain solujen kypsymisen ja erilaistumisen kautta. Sytokeratiinin ilmentyminen ihmisen keratinosyyteissä muuttuu in vitro EBV-infektion jälkeen, mikä johtaa niiden muuttumiseen fibroblasteiksi . Fibroblastit voivat fagosytoida keratiiniaggregaatteja ja muuntaa ne amyloidiksi .
Drago ym. osoittivat tämän korrelaation Italiassa vuonna 1996. Heidän potilaansa oli 30-vuotias nainen, jolla oli kymmenen vuoden ajan ollut kutiavia ruskeita papuloita ja makuloita rinnassa ja selässä ja kroonisen väsymysoireyhtymän oireita. He pystyivät osoittamaan EBV:n genomin epidermisleesioissa käyttämällä in situ -hybridisaatiotekniikkaa. EBV-genomi näkyi pääasiassa epidermiksen tyvisoluissa sekä ylemmän kerroksen soluissa, erityisesti sytoplasmassa. Myös serologiset testit EBV:lle olivat potilaalla positiivisia. Antiviraalinen hoito asikloviirilla ja interferoni alfalla paransi potilaan ihomuutoksia ja yleisoireita. Chang et al. tekivät toisen tutkimuksen 27 potilaan ihokudoksesta, joilla oli diagnosoitu jäkälä- ja makulaarinen amyloidoosi Taiwanissa vuonna 1997. In situ -hybridisaatiomenetelmä osoitti EBV-DNA:ta 11 potilaan (40,7 %) leesioissa, kun taas kontrolliryhmässä (johon kuului kolme potilasta, joilla oli sekundaarinen ihoamyloidoosi, kaksi potilasta, joilla oli primaarinen systeeminen amyloidoosi, ja neljä potilasta, joilla oli krooninen simpleksijäkälä) EBV-DNA:ta ei löytynyt .
Tämän tutkimuksen mukaan EBV:n ja makulaarisen amyloidoosin väliltä puuttui EBV-DNA:ta ( ). Tutkimuksessamme EBV-DNA:ta esiintyi kahdeksalla makulaarista amyloidoosia sairastavalla potilaalla ja 15 kontrollipotilaalla. Ero EBV-DNA:n havaitsemisasteessa makulaarista amyloidoosia sairastavien potilaiden ja kontrollien välillä tässä tutkimuksessa ja mainituissa tutkimuksissa voi johtua seuraavista syistä:(1)Makulaarisen amyloidoosin ja EBV-infektion välisen yhteyden puuttuminen: muutamissa tutkimuksissa ei ole riittävästi näyttöä EBV:n ja makulaarisen amyloidoosin välisestä lopullisesta korrelaatiosta, joten tutkimuksessamme saatujen tuloksien perusteella voitiin tehdä tämä johtopäätös.(2)Menetelmä (PCR vs. in situ -hybridisaatio): käytimme herkkää EBV-DNA:n havaitsemismenetelmää, jossa oli sekä positiivisia että negatiivisia kontrolleja. Aiempien tutkimusten perusteella PCR on yhtä herkkä kuin in situ -hybridisaatio . Koska emme kuitenkaan käyttäneet in situ -hybridisaatiota, emme pystyneet paikallistamaan tarkalleen EBV:n infektoimaa solua kontrolleissamme, jotka saattoivat olla ihon kiertäviä B-soluja keratinosyyttien sijaan. Koska käytimme positiivisia ja negatiivisia kontrolleja EBV:n PCR-pakkauksessamme, kontrolliryhmämme positiiviset tapaukset eivät voineet olla vääriä positiivisia. 3) Kontrollit: Tutkimuksessamme kontrollit olivat tervettä ihoa melanosyyttisten nevojen ympärillä, mutta Changin tutkimuksessa kontrollit olivat muita ihon sairauksia. 4) Ihon amyloidoosin tyyppi: Tutkimuksessamme kaikilla potilailla oli makulaarista amyloidoosia, mutta molemmissa aiemmissa tutkimuksissa suurin osa potilaista sairasti jäkäläamyloidoosia.
5. Johtopäätös
Tämän tutkimuksen tulosten mukaan EBV:n ja makulaarisen amyloidoosin välillä ei ollut yhteyttä. Suosittelemme tuoreen kudoksen tai nopeasti pakastetun biopsianäytteen käyttöä sekä potilaiden samanaikaista serologista tutkimusta EBV-vasta-aineiden varalta tarkempien tulosten saamiseksi EBV-DNA:n vertailevassa tutkimuksessa makulaarisessa amyloidoosissa. In situ PCR:ää voidaan käyttää myös EBV-DNA-positiivisten solujen paikallistamiseen näytteissä. EBV:n havaitsemiseen kudoksesta voidaan käyttää muitakin geenejä, koska joissakin EBV-näytteissä on mutaatio tässä tutkimuksessa käytetyn BLLF1-geenin osalta .
Suosittelemme myös vertailevan tutkimuksen suorittamista EBV:n havaitsemiseksi sekä mukana olevasta että ei mukana olevasta ihosta potilailla, joilla on makulaarinen amyloidoosi.
Interressiristiriita
Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja.
Kiitokset
Tekijät ilmaisevat syvän kiitollisuutensa MUMS:n tutkimusvarajohtajalle taloudellisesta tuesta ja Narges Nazerin opinnäytetyöhön liittyvän tutkimushakemuksen (nro 911283) hyväksymisestä. Mashhadin lääketieteellisen tiedeyliopiston tutkimuksen sijaisen antama taloudellinen tuki on kiitollinen.