T-säätelysolut (Tregit), jotka aiemmin tunnettiin nimellä T-suppressorisolut, ovat T-solujen alaryhmä, jolla on suoria rooleja sekä autoimmuniteetissa että vasteissa patogeeneihin.
Tregit vähentävät tulehdusta immunosuppressiivisten sytokiinien (IL-10, TGF-b) erittymisen kautta ja myös tukahduttamalla suoraan tulehdusta aiheuttavia efektori-T-soluja (kuten Th1- ja Th17-soluja).
Tregit kontrolloivat ja todennäköisesti ehkäisevät autoimmuunisairauksia myötävaikuttamalla toleranssin ylläpitämiseen itseantigeenejä kohtaan. Treg-siirrosta saatava terapeuttinen hyöty on vakiintunut eläinmalleissa, ja parhaillaan pyritään aloittamaan ihmisen Treg-hoitoja elinsiirtoja ja tyypin 1 diabetesta sairastavia potilaita varten.
Kun otetaan huomioon tämän ainutlaatuisen T-solujen alaryhmän merkitys niin monissa immuunivasteissa, monet tutkijat tuntevat olevansa huolimattomia, jos he immunofenotyypittävät kiinnostuksen kohteena olevia solupopulaatioitaan ilman, että he ottavat mukaan Treg-mittauksen kokonaisuuteen. Tregien kvantifiointi voi kuitenkin olla monimutkaista.
Mitkä ovat esimerkiksi parhaat käytettävät markkerit? Mistä tiedät varmasti, että mittaat todellisia suppressori-T-soluja?
Gating Strategies For Defining Tregs By Flow Cytometry
Standardi Treg-gating-strategia sekä hiiri- että ihmisnäytteille (sen jälkeen, kun on ensin gatingattu dubletit pois ja gatingattu elävillä soluilla) sisältää antigeenit CD3, CD4, CD25, FOXP3 ja CD127.
Kun tarkastellaan pelkästään antigeeniekspressiota, Tregit määritellään usein CD3+, CD4+, CD25hi, FOXP3+ ja CD127lo:ksi (alla olevassa kuvassa vaihtoehto 1). Näitä merkkiaineita käyttämällä näytteistä, kuten hiiren pernosyyteistä ja ihmisen PBMC:stä, on usein havaittavissa selkeä populaatio.
Aktiiviset T-solut kuitenkin sääntelevät usein CD25:tä, ja FOXP3:n ilmentymistä on havaittu ”efektori” (ei-suppressiivisissa) T-solulinjoissa. Näin ollen, kun Tregien määrittelyssä luotetaan pelkästään virtaussytometriseen fenotyypitykseen, tulehdukselliset T-solut voivat olla susi lampaan (Treg) vaatteissa ja johtaa virheelliseen datan tulkintaan.
Solu voi näyttää ankalta, mutta kukkoileeko se? Mahdollisen Treg-populaatiosi efektoritoimintojen mittaaminen auttaa suuresti selvittämään virtausportointistrategian tarkkuutta. Sen määrittämiseksi, muistuttavatko Treg-soluiksi määrittelemäsi solut toiminnallisesti Treg-soluja, vaihtoehto 2 (ks. jäljempänä) sisältää FOXP3:n jättämisen pois paneelista, CD3+-, CD4+-, CD25hi-, CD127lo-solujen lajittelun ja sen jälkeen Treg-populaatiosi toimintojen määrittämisen sytokiinianalyysin ja/tai muiden kuin Treg-treg-solujen (CD3+, CD4+, CD25- ja CD127hi-solujen) kanssa tehtyjen suppressiokokeilujen avulla. Tyypillisesti FOXP3:a ei voida sisällyttää paneeleihin, joissa tarvitaan elinkelpoisia soluja lajittelun jälkeen, koska tarvitaan solunsisäistä värjäystä.
Treg-alaryhmien lisääntyvän monimuotoisuuden määrittäminen
Tregejä on montaa erilaista tyyppiä, mukaan lukien tTregit, pTregit ja iTregit.
Esimerkiksi tTregit (tunnetaan myös nimellä nTregit) syntyvät kateenkorvassa, ja niillä on TcR-repertuaari, joka on puolueellisesti suuntautunut omiin peptideihin. Toinen maku, joka tunnetaan nimellä pTregit, syntyy periferiassa, ja iTregit indusoidaan kulttuurissa TGF-b:n avulla.
Näihin erilaisiin Treg-alakokonaisuuksiin liittyy tekijöitä, ja niiden sisällyttämistä Treg-vasta-ainepaneeliin olisi harkittava, jos niiden alaryhmitys kiinnostaa. Esimerkiksi ihmisillä CD39:ää pidetään luotettavana tTreg-markkerina. Lisäksi sekä hiirillä että ihmisillä Heliosin on havaittu erottelevan luotettavasti tTreg:t p- ja iTreg-alaryhmistä.
Yksittäisen solun määrittäminen Treg:ksi – onko se mahdollista?
Suurimpana rajoitteena Treg-tutkimuksessa on yksittäisen solun suppressiomäärityksen puuttuminen.
Yksittäisen T-solun määrittäminen erillisen muistilinjan, kuten Th1-, Th2- tai Th17-linjan, jäseneksi voidaan toteuttaa analyysianalyysillä, jossa on yksittäisen solun resoluutio, kuten solunsisäisellä sytokiinivärjäyksellä, koska nämä solut määritellään ensisijaisesti, jos ei yksinomaan, sen perusteella, mitä sytokiinejä ne tuottavat.
Mutta osoittaaksemme, että yksittäinen solu on Treg, haluamme mieluiten pystyä kvantifioimaan, että tämä yksi valittu solu pystyy tukahduttamaan efektori-T-solujen (tai muiden solujen osajoukkojen) toiminnan yhteiskulttuurissa. Tällä hetkellä ainoa tapa testata Tregien suppressiivista toimintaa on bulkkiviljely, jossa voidaan päätellä, että osa (mutta ei kaikki, mahdollisesti ei edes suurin osa) Tregeiksi nimetyistä soluista on suppressiivisia.
Ajattelemme jälleen mahdollisia ”efektori-T-solujen” susia lampaiden vaatteissa, joten emme vain tiedä, kuinka paljon ei-suppressiivisia, jopa tulehdusta aiheuttavia, soluja piileskelee Treg-porrastressointistrategiassamme. Käyttämällä virtaussytometriaa, jossa ensin portitetaan ja lajitellaan elinkelpoiset solut, joiden markkerit vastaavat Treg-soluja, ja sen jälkeen testataan funktionaalisesti, toimivatko porttistrategian määrittelemät solut ryhmänä todella Treg-solujen tavoin, on tällä hetkellä paras tapa kvantifioida Treg-solut näytteessäsi.
Käyttämällä oikeanlaisia porttistrategioita Treg-solujen määrittelemiseksi virtaussytometrialla ja huomioimalla kasvava määrä Treg:n osajoukkoja voit saada selville, mitkä ovat kiinnostuksen kohteena olevat Treg-populaatiot. Avainasemassa on näiden populaatioiden toiminnallinen testaaminen niiden tunnistamisen jälkeen, koska tällä hetkellä yksittäisen solun määritteleminen Treg-soluksi on vaikeaa, ellei mahdotonta. Edistystä tapahtuu kuitenkin päivittäin, ja lopulta yksittäisten Treg-solujen merkitseminen oikein on mahdollista.
Jos haluat oppia lisää T-solujen ja muiden solutyyppien analysoinnista virtaussytometrialla ja päästä käsiksi kaikkiin kehittyneisiin materiaaleihimme, mukaan lukien 20 koulutusvideota, esityksiä, työkirjoja ja yksityisen ryhmän jäsenyys, ilmoittaudu virtaussytometriamestarikurssin odotuslistalle.
.