Molekyylikloonaus on joukko tekniikoita, joita käytetään rekombinantti-DNA:n lisäämiseksi prokaryoottisesta tai eukaryoottisesta lähteestä replikoituvaan välineeseen, kuten plasmidiin tai virusvektoriin. Kloonauksella tarkoitetaan lukuisien kopioiden valmistamista kiinnostavasta DNA-fragmentista, kuten geenistä. Tässä videossa tutustutaan molekyylikloonauksen eri vaiheisiin, menettelyn järjestämiseen ja tämän tekniikan eri sovelluksiin.
Vähintään kaksi tärkeää DNA-molekyyliä tarvitaan ennen kloonauksen aloittamista. Ensinnäkin, ja mikä tärkeintä, tarvitset kloonattavan DNA-fragmentin, joka tunnetaan myös nimellä insertti. Se voi olla peräisin prokaryootista, eukaryootista, sukupuuttoon kuolleesta organismista tai se voidaan luoda keinotekoisesti laboratoriossa. Molekyylikloonauksen avulla voimme oppia lisää tietyn geenin toiminnasta.
Toiseksi tarvitset vektorin. Vektori on plasmidi-DNA, jota käytetään molekyylibiologian välineenä, jotta tietystä geenistä voidaan tehdä useampia kopioita tai tuottaa proteiinia. Plasmidit ovat esimerkki vektorista, ja ne ovat pyöreää, ekstrakromosomaalista DNA:ta, jota bakteerit monistavat.
Plasmidissa on tyypillisesti moninkertainen kloonauspaikka eli MCS, tämä alue sisältää tunnistuskohtia erilaisille restriktioendonukleaaseille, jotka tunnetaan myös restriktioentsyymeinä. Erilaiset insertit voidaan liittää plasmidiin tekniikalla, jota kutsutaan ligaatioksi. Plasmidivektorissa on myös replikaatioalkio, jonka ansiosta se voi replikoitua bakteereissa. Lisäksi plasmidissa on antibioottigeeni. Jos bakteeri sisällyttää plasmidin, se selviytyy antibioottia sisältävässä väliaineessa. Tämä mahdollistaa onnistuneesti transformoitujen bakteerien valinnan.
Insertti ja vektori kloonataan isäntäsoluorganismiin, yleisin molekyylikloonauksessa käytetty on E. coli. E. coli kasvaa nopeasti, sitä on laajalti saatavilla ja sitä valmistetaan kaupallisesti lukuisia erilaisia kloonausvektoreita. Eukaryootteja, kuten hiivaa, voidaan myös käyttää vektorien isäntäorganismeina.
Yleisen molekyylikloonausmenettelyn ensimmäinen vaihe on saada haluttu insertti, joka voi olla peräisin minkä tahansa solutyypin DNA:sta tai mRNA:sta. Optimaalinen vektori ja sen isäntäorganismi valitaan sitten insertin tyypin ja sen perusteella, mitä sillä lopulta tehdään. Insertin monistamiseen käytetään usein polymeraasiketjureaktiota eli PCR:ään perustuvaa menetelmää.
Sitten insertti ja digesti liitetään yhteen entsymaattisten reaktioiden avulla ja viedään isäntäorganismiin massareplikointia varten. Monistetut vektorit puhdistetaan bakteereista, ja restriktiodigestion jälkeen ne analysoidaan geelillä. Geelillä puhdistetut fragmentit lähetetään myöhemmin sekvensoitavaksi, jotta voidaan varmistaa, että insertti on haluttu DNA-fragmentti.
Katsotaanpa hieman tarkemmin, miten molekyylikloonaus suoritetaan. Ennen kuin aloitat, sinun kannattaa suunnitella kloonausstrategia, ennen kuin teet mitään kloonausyrityksiä penkissä. Esimerkiksi mikä tahansa plasmidivektori tarjoaa sinulle rajallisen määrän restriktiokohtia, joihin insertti voidaan sisällyttää moninkertaisen kloonauspaikan kautta. Sinun on valittava restriktiokohdat, joita ei ole insertissäsi, jotta et pilko sitä. Saatat joutua tilanteeseen, jossa joudut yhdistämään tylpän pään fragmentin sellaiseen fragmenttiin, jossa on overhang. Jos näin on, klenow-fragmentin käyttäminen tylpän pään ligatioon saattaa olla ainoa vaihtoehto insertin saamiseksi haluamaasi vektoriin. Käytettävissäsi olevien erilaisten molekyylikloonaustyökalujen ymmärtäminen sekä huolellisen strategian laatiminen ennen kloonauksen aloittamista voi säästää valtavasti aikaa.
Molekyylikloonauksessa käytettävän DNA:n lähde voidaan eristää lähes mistä tahansa solu- tai kudosnäytteestä yksinkertaisilla uuttotekniikoilla. Kun insertti on eristetty, voidaan käyttää PCR:ää insertin monistamiseen.
Kun insertti on monistettu, sekä se että vektori pilkotaan restriktioentsyymeillä, joita kutsutaan myös restriktioendonukleaaseiksi.
Kun insertti ja vektori on pilkottu, ne voidaan ajaa geelillä ja puhdistaa geelipuhdistukseksi kutsutulla prosessilla. Vektorin osalta tämä vaihe auttaa puhdistamaan linearisoidun plasmidin leikkaamattomasta plasmidista, jolla on taipumus näkyä geelillä korkean molekyylipainon tahroina.
Digestien geelipuhdistuksen jälkeen insertti ligatoidaan tai liitetään plasmidiin DNA-ligaasiksi kutsutun entsyymin avulla.
Yleisesti ottaen on aina hyvä ajatus asettaa ligaatiot siten, että insertin ja vektorin suhde on 3:1, jolloin varmistetaan, että vain pieni osa vektorista ligoituu itsestään. Kun ligaatio on asetettu jäälle, sitä inkuboidaan missä tahansa 14-25˚C:n lämpötilassa 1 tunnista yön yli.
Seuraavaksi suoritetaan transformaatio, jolla plasmidivektori siirretään isäntään, joka replikoi sen.
Transformaation jälkeen bakteerit istutetaan agar-levyille antibiootilla ja inkuboidaan yön yli 37 °C:ssa. Koska plasimidissa on antibioottiresistenssigeeni, onnistunut transformaatio tuottaa bakteeripesäkkeitä, kun niitä kasvatetaan agar-levyillä antibioottien läsnä ollessa. Yksittäiset pesäkkeet voidaan sitten poimia transformoidulta levyltä, sijoittaa nestemäiseen kasvualustaan numeroituihin putkiin ja laittaa ravisteluinkubaattoriin laajenemista varten. Pieni määrä nestemäistä viljelmää lisätään numeroidulle agarlevylle, kun taas loput viljelmästä siirretään plasmidipuhdistukseen. Numerointijärjestelmä, joka osoittaa niiden bakteeripesäkkeiden identiteetin, joista plasmidit lopulta puhdistetaan, säilyy koko plasmidipuhdistusprosessin ajan.
Puhdistetun plasmidin näyte leikataan restriktioentsyymeillä. Tämän jälkeen digesti ladataan ja ajetaan geelille insertin esiintymisen tarkistamiseksi, mikä todentaa, että bakteeripesäke on transformoitu insertin sisältävällä plasmidilla eikä itseligoituneella plasmidilla. Bakteerit, joiden osalta on varmistettu, että ne on transformoitu insertin sisältävällä plasmidilla, laajennetaan plasmidipuhdistusta varten. Sekvensointi suoritetaan viimeisenä varmennusvaiheena sen varmistamiseksi, että kiinnostava geeni on kloonattu.
Molekyylikloonausta voidaan käyttää lähes rajattomaan määrään sovelluksia. Kun esimerkiksi mRNA-malli käänteistranskriptioidaan cDNA:ksi eli komplementaariseksi DNA:ksi käänteistranskriptaasiksi kutsutun entsyymin avulla ja sen jälkeen käytetään PCR:ää cDNA:n monistamiseen, molekulaarista kloonausta voidaan käyttää cDNA-kirjaston luomiseen, joka on kirjasto kaikista tietyn solutyypin ilmentämistä geeneistä.
Molekyylikloonausta voidaan käyttää myös ottamaan sarja geenejä tai geeniryhmä yhdestä bakteerikannasta, järjestämään ne uudelleen plasmideiksi, jotka muunnetaan toiseen kantaan, jolloin kokonainen biosynteesireitti voidaan luoda uudelleen monimutkaisen molekyylin tuottamiseksi.
Molekyylikloonauksen avulla voidaan luoda mutanttikirjasto ekspressoimalla kohdeplasmidi erityisessä bakteerikannassa, joka viljeltäessä määrätyissä lämpötiloissa käyttää vikaherkkää polymeraasia. Mutaatiot voidaan karakterisoida sekvensoimalla. Mutaatiogeeneillä muunnettuja bakteereja voidaan sitten testata erilaisilla lääkkeillä tai kemikaaleilla, jotta nähdään, mitkä bakteeripesäkkeet ovat kehittyneet lääkeresistentiksi.
Molekulaarisen kloonauksen ansiosta reportterigeenejä voidaan sisällyttää DNA-plasmideihin, yleinen reportterigeeni on vihreä fluoresoiva proteiini eli GFP, joka säteilee vihreää fluoresenssia, kun se altistetaan UV-valolle. Reportterigeeni voidaan myös lisätä alfavirukseen, jotta voidaan osoittaa tartunta hyttysissä ja tarttuvuus soluissa.
Olet juuri katsonut JoVEn videon molekyylikloonauksesta. Sinun pitäisi nyt ymmärtää, miten molekyylikloonaus toimii ja miten tekniikkaa voidaan käyttää molekyylibiologiassa. Kuten aina, kiitos katsomisesta!