Esittely

Valkoisena, värittömänä ja kiteisenä jauheena natriumatsidi (NaN3) luokitellaan erittäin myrkylliseksi aineeksi. Sen myrkylliset vaikutukset muistuttavat syanidin vaikutuksia, ja se vahingoittaa hermo- ja verenkiertoelimistöä, silmiä ja ihoa. Tämä myrkyllinen aine aktivoituu nopeasti nauttimisen jälkeen, ja sen pääasialliset vaikutukset ilmenevät useita tunteja oraalisen nauttimisen jälkeen nautitusta määrästä riippuen (1,2). Altistuminen NaN3:lle voi aiheuttaa muutamassa minuutissa useita oireita, kuten pahoinvointia, oksentelua, päänsärkyä, levottomuutta, huimausta, heikkoutta, nopeaa hengitystä ja nopeaa sydämenlyöntiä (3). Suuret määrät tätä myrkyllistä ainetta aiheuttavat välittömästi kouristuksia, tajuttomuuden menetyksen, alhaisen sykkeen ja verenpaineen sekä hengitysvajauksen, mikä johtaa lopulta kuolemaan (3). NaN3:n osoitetuista vaikutusmekanismeista tärkein on sytokromioksidaasi-hengitysketjukompleksin esto (4). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NaN3, kompleksi IV:n (Cox IV) estäjä, voi indusoida primaaristen kortikaalisten neuronien apoptoosia, joka on kaspaasi-3-riippuvainen ja liittyy sytokromi c:n vapautumiseen (5).

Mitokondriaalisessa biosynteesissä hengitysketjun Cox IV:n promoottori voi aktivoitua ydinsisäisten respiratoristen faktoreiden (Nrf)-1/2 avulla. Samalla Nrf:ää voidaan säätää säätelemällä mitokondriaalista transkriptiotekijä A:ta (Tfam) koodaavien geenien aktiivisuutta, jolloin se säätelee epäsuorasti hengitysketjugeenien ilmentymistasoja. Nrf-1/2, Tfam, peroksisomeja aktivoiva proliferaattorireseptori γ:n koaktivaattori 1-α (Pgc-1α) ja muut koaktivaattorit muodostavat Pgc-1α-signaalikaskadin, joka on keskeisessä roolissa säätöverkossa, joka ohjaa mitokondrioiden biogeneesin ja hengitystoiminnan transkriptionaalista valvontaa. Tässä signaalikaskadissa Pgc-1α aktivoi ensin Nrf-1/2:n sen sijaan, että se sitoutuisi suoraan mitokondrioiden DNA:han, ja Nrf-1/2 indusoi Tfam:n aktivoitumisen yhdessä Tfam:n promoottorin kanssa ja käynnistää mitokondrioiden DNA:n transkription ja replikaation, mikä johtaa mitokondrioproteiinien lisääntyneeseen ilmentymiseen(6). Samanaikaisesti Pgc-1α voi aktivoitua CaN-, Ca2+/kalmoduliini-riippuvaisen proteiininkinaasin (CaMK), mitogeeniaktivoituneen proteiinikinaasin (MAPK) ja sykliini-riippuvaisen kinaasin välittämien signaalireittien kautta (7). Tässä tutkimuksessa PC12-soluja käytettiin dopamiinineuronimallin luomiseen, ja NaN3:n vaikutuksia ja mekanismeja Pgc-1α:aan liittyviin reitteihin PC12-soluissa tutkittiin, jotta voitiin selvittää, aiheuttaako NaN3 myrkyllisyyttä viljellyissä PC12-soluissa ja mitkä ovat näiden vaikutusten taustalla olevat mekanismit.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kissan feokromosytooma PC12-solut ostettiin Kiinan tiedeakatemian tyyppiviljelykokoelman solupankista (Shanghai, Kiina). NaN3:n kantaliuos (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) liuotettiin steriiliin keittosuolaliuokseen, jotta saatiin 1 M kantaliuos, joka laimennettiin haluttuihin pitoisuuksiin ennen kokeita. Yksivaiheinen TUNEL Apoptosis Assay Kit (C1090), Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) Apoptosis Detection Kit (C1063), Enhanced adenosine 5′-triphosphate (ATP) Assay Kit (S0027), JC-1 Mitokondrioiden kalvopotentiaalin määrityssarja (C2006) ja Reaktiivisten happispesien määrityssarja (S0033) toimitti Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kiina).

Soluviljely ja elinkelpoisuusmääritys

PC12-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa kotkan elatusaineessa (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan, Logan, UT, USA), jota täydennettiin 10 %:lla naudan sikiön seerumilla (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.,, Waltham, MA, USA) ja 1 % antibiootti-antimykoottiliuosta, joka koostuu 10 000 U penisilliinistä ja 10 000 U streptomysiinistä. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % CO2:n kostutetussa ilmakehässä, ja niitä käytettiin aina 70-80 %:n konfluenssissa.

Pc12-solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä solulaskentasarjaa (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Shanghai, Kiina). Solut kylvettiin 96-kuoppalevyihin tiheydellä 1×105/kuoppa. 24 tunnin viljelyn jälkeen soluja käsiteltiin NaN3:lla (0-80 mM) ja inkuboitiin 12, 24, 48 ja 72 tuntia soluvauriomallin luomiseksi. Tämän jälkeen jokaiseen kuoppaan lisättiin 10 µlCCK-8-liuosta (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) ja inkuboitiin vielä 2 tuntia vakio-olosuhteissa (37 °C ja 5 % CO2). Absorbanssi aallonpituudella 450 nm määritettiin ELx808 Absorbance MicroplateReader -laitteella (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Solujen elävyys laskettiin kuuden kuopan optisen tiheyden keskiarvon mukaan. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena. Sopivat NaN3-pitoisuudet myöhempiä kokeita varten määritettiin solujen elävyysmääritysten tulosten perusteella.

DAPI-värjättyjenPC12-solujen ydinmorfologia

PC12-solut altistettiin 0, 10, 20 ja 40 mMNaN3:lle 24 tunnin ajan. Ohjelmoidun solukuoleman erottamiseksi ei-apoptoottisesta solukuolemasta tumat värjättiin 10 µg/ml DAPI:llä (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Lyhyesti sanottuna solut pestiin kahdesti PBS:llä ja kiinnitettiin sitten 4-prosenttisella paraformaldehydillä huoneenlämmössä 30 minuutin ajan. Kolmen pesun jälkeen kiinnitetyt solut värjättiin DAPI:lla (1:5 000) 5 minuutin ajan ja pestiin sitten PBS:llä. Fluoresenssikuvat otettiin Leica DMI -fluoresenssimikroskoopilla (suurennos, ×400).

Apoptoosinopeuden mittaaminen

Solujen apoptoosin määrittämiseen käytettiin Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kitiä (Beyotime Institute of Biotechnology) solujen apoptoosin määrittämiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti.Kokeet toistettiin kolmena kappaleena ja suoritettiin seuraavasti: Kontrolli-PC12-solujen (0 mMNaN3) ja 10, 20 ja 40 mMNaN3:lle 24 tunnin ajan altistettujen PC12-solujen apoptoosinopeus mitattiin virtaussytometrialla (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS-tilasto-ohjelmistolla v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Mitokondrioiden kalvopotentiaalin (ΔΨm)

ΔΨm on merkittävä mitokondrioiden toiminnan parametri. Sitä arvioitiin värjäämällä JC-1:llä, fluoresenssisondilla. Kokeet toistettiin kolmena kappaleena, ja ne suoritettiin seuraavasti: Tämän jälkeen soluja inkuboitiin JC-1:tä (1X) sisältävässä väliaineessa 37 °C:ssa 20 minuutin ajan 20 minuutin ajan, solut pestiin kolme kertaa pesupuskurilla ja kerättiin tuoreella väliaineella, jossa ei ollut seerumia (C2006; mitokondrioiden membraanipotentiaalin määrityssarja; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kiina). Samanaikaisesti positiivista kontrollia käsiteltiin karbonyyli-syanidi3-kloorifenyylihydratsonilla (CCCP), inhibiittorilla (10 µM) 37 °C:ssa 20 minuutin ajan. Tämän jälkeen punainen/vihreä fluoresenssi määritettiin FCM:llä (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Punaisen fluoresenssin intensiteetin ja vihreän fluoresenssin intensiteetin suhteet edustivat ΔΨm:n tasoja.

Reaktiivisten happilajien (ROS) tuotannon mittaaminen

ROS PC12-soluissa arvioitiin käyttämällä ReactiveOxygen Species Assay -määrityssarjaa (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, Kiina). Solunsisäistä ROS-tuotantoa arvioitiin fluoresoivalla 2′,7′-dikloorifluoresceiinidiasetaatilla (DCFH-DA). Solunsisäinen ROS hapettaa DCFH-DA:n, jolloin saadaan fluoresoiva yhdiste 2′,7′-dikloorifluoresceiini (DCF), ja DCFfluoresenssin voimakkuuden katsotaan olevan samansuuntainen muodostuneen ROS:n määrän kanssa ROS-määrityssarjan ohjeiden mukaisesti.Kokeet toistettiin kolmena kappaleena ja suoritettiin seuraavasti: Positiivinen kontrolli käsiteltiin Rosupin spesifisellä konsentraatiolla (50 mg/ml); kontrolli-PC12-soluja käsiteltiin 0 mMNaN3:lla; ja kokeelliset PC12-solut altistettiin 10, 20 ja 40 mM:lle NaN3:lle 24 tunnin ajan. Lisäksi PC12-soluja käsiteltiin seerumivapaaseen DMEM:iin (1:1000) liuotetulla DCFH-DA:lla (10 mM) 20 minuutin ajan 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen PC12-soluja pestiin kolmesti seerumivapaalla DMEM:llä. Positiivista kontrollia käsiteltiin Rosupilla ROS-tuotannon indusoimiseksi. ROS-tuotanto määritettiin FCM:llä (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Keskimääräiset fluoresenssin intensiteetit (MFI) edustivat ROS-tasoja.

Solujen ATP-pitoisuuden mittaaminenPC12-soluissa

Kokeet toistettiin kolmena kappaleena ja suoritettiin seuraavasti: Tämän jälkeen solujen ATP-pitoisuus määritettiin käyttämälläFirefly Luciferase ATP Assay kittiä (Beyotime Institute ofBiotechnology) valmistajan protokollan mukaisesti.

Western blot -analyysi

PC12-solut altistettiin 0, 10, 20 ja 40 mMNaN3:lle 24 tunnin ajan, lysoitiin radioimmunoprecipitation assaylysis-puskurissa (Beyotime Institute of Biotechnology), joka sisälsi aproteaasi-inhibiittoria, ja sentrifugoitiin 13 362 × g:n voimakkuudella 10 minuuttia 4 °C:n lämpötilassa ylijäämäaineksen keräämiseksi. Tämän jälkeen proteiinipitoisuudet määritettiin käyttämällä BCA-kittiä (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Yhtä suuret määrät proteiineja (90 µg) tutkittiin 10 ja 12 % SDS-PAGE:lla, minkä jälkeen ne siirrettiin polyvinylideenifluoridikalvoille (0,45 µm) käyttäen Semidry Electro-transfer Unit -laitetta (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Estämisen jälkeen 5 %:lla naudan seerumin albumiinilla TBS:ssä, joka sisältää 0.1 % Tween-20 (TBST) 2 tunnin ajan huoneenlämmössä, kalvoja inkuboitiin ensisijaisilla vasta-aineilla Pgc-1α:ta (Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:500), Nrf-2:ta (Abcam; 1:500), Cox IV:tä (Abcam; 1:1 000), Tfam:ia (Abcam; 1:1 000), prokaspaasi-3:ta (Abcam; 1:500), Nrf-1:tä (Cell SignalingTechnology, Inc., Danvers, MA, USA, 1:500), pan-kalsineuriini A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1 000), fosforyloitu (p)-CaMKII (Cell Signaling Technology; 1:1 000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc., 1:1 000).; 1:1 000), p-extrasellulaarisen signaalin säätelemä kinaasi (Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1 000), B-solulymfooma-2 (Bcl-2)-assosioitunut X-proteiini (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) ja sytokromi c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) 4 °C:ssa yön yli. Kalvot pestiin sen jälkeen TBST:llä ja inkuboitiin hevosenpunikkaperoksidaasilla (HRP) konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella (kani; kat. nro. A0208; 1:1 000; tai hiiri; cat. no. A0216; 1;1,000; molemmat Beyotime Instituteof Biotechnology) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Immunoreaktiiviset bändit visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssijärjestelmällä (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Kiina) ja kvantitatiivisesti analysoitiin Image J:n versiolla l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, USA), ja β-aktiini valittiin lastauskontrolliksi.

Statistinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSSstatistical-ohjelmistolla v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± keskihajonta keskivirhe. Ryhmien välisten erojen tilastollinen merkitsevyys määritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seurasi Bonferronin post-hoc-testi. P<0,05 katsottiin osoittavan tilastollisesti merkitsevää eroa. Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa.

Tulokset

NaN3 estääPC12-solujen kasvua

NaN3-altistuksen vaikutus PC12-solujen proliferaatioon arvioitiin CCK-8-määrityksellä. Soluja altistettiin eri pitoisuuksille (0-80 mM) NaN3:a 12-72 tunnin ajan. TaulukkoI ja kuvat 1A-D osoittavat, että NaN3 vähensi solujen elinkelpoisuutta pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Lähes 100 prosenttia soluista kuoli altistuttuaan 80 mM NaN3:lle 72 tunnin ajan, mikä osoittaa, että NaN3 aiheutti selvästi solukuolemaa, ja NaN3:n sytotoksisuus havaittiin annoksesta ja ajasta riippuvaisena. Altistaminen NaN3:lle 20 mM:n pitoisuudella 24 tunnin ajan aiheutti merkittävän solukuolemanPC12-soluissa (50 %). Siksi 24 tuntia viljeltyjä soluja käytettiin myöhempiin kokeisiin.

Solujen morfologia

DAPI-värjäyksessä PC12-solujen morfologisia muutoksia havainnoitiin fluoresenssimikroskopialla sen jälkeen, kun ne olivat altistuneet eri NaN3-pitoisuuksille. NaN3:lle 24 tunnin ajan altistettujen solujen tuman fragmentoitumista havaittiin, ja solujen tuman kutistuminen ja kromatiinin tiivistyminen lisääntyivät hieman NaN3:n pitoisuuden kasvaessa PC12-soluissa kontrolliin verrattuna. Näissä soluissa apoptoottiset solut olivat pienempiä ja kirkkaampia kuin normaalit solut. Myös kromatiinin tiivistymistä ja ytimen pirstoutumista havaittiin, kun taas kontrolliryhmässä havaittiin elinkelpoisten solujen sinisiä tumia.Lisäksi apoptoottisten solujen määrä ja vihreän fluoresenssin voimakkuus lisääntyivät soluissa, jotka altistuivat NaN3:lle (kuva 2).

Apoptoosinopeuden määrittäminen Annexin V-FITC-värjäyksellä

Kuolleet solut tai myöhäisempiä apoptoottisia soluja olevat solukalvot, jotka ovat menettäneet solukalvojen koskemattomuuden, voivat värjäytyä propidiumjodidilla. Tämän solukalvon eheyden menettämisen vuoksi Annexin V-FITC voi päästä sytoplasmaan ja yhdistyä solukalvon sisäpuolella olevaan fosfatidyyliseriiniin, mikä osoittaa vihreää fluoresenssia kuolleissa soluissa.Kuva 3 osoittaa, että apoptoottisten solujen määrät olivat 5,03, 8,02, 43,77 ja 78,67 % (P<0,05) PC12-soluissa sen jälkeen, kun PC12-soluja oli altistettu NaN3:lle eri pitoisuuksina (0-, 10-, 20-, ja 40 mM:n pitoisuuksina) 24 tunnin ajan. Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että NaN3 indusoi solujen apoptoosia annosriippuvaisesti.

Mitokondrioiden kalvopotentiaalin muutokset (ΔΨm)

Mitokondrioita pidetään yleisesti keskeisinä solujen elinkelpoisuutta säätelevinä soluina. Siksi ΔΨm:ää käytettiin mitokondrioiden toiminnan indikaattorina. PC12-solut värjättiin JC-1:llä, kationisella väriaineella, jolla on potentiaalista riippuvainen kertyminen mitokondrioihin. Punaista fluoresenssia (J-aggregaatit), joka edustaa aktiivisia mitokondrioita, joiden kalvopotentiaali on vakaa, havaittiin pienessä määrässä soluja, jotka altistettiin kasvaville NaN3-pitoisuuksille. Sitä vastoin useissa soluissa havaittiin vihreää fluoresenssia (J-monomeri), joka edustaa apoptoottisia mitokondrioita, joiden ΔΨm on vaurioitunut. Punaisen ja vihreän fluoresenssin suhde väheni vähitellen kontrolliryhmässä (kuva 4).

NaN3:n aiheuttama mitokondriaalisten ROS:ien kertyminen

On hyvin tiedossa, että mitokondriot ovat solujen ROS:ien ensisijainen lähde ja että ROS:illa on tärkeä rooli apoptoottisen signaloinnin aktivoinnissa. Siksi tutkittiin lisäksi ROS:ien rooliaNaN3:n aiheuttamassa PC12-solukuolemassa. Kuva 5 osoittaa, että fluoresenssin intensiteetit kontrollisoluissa ja soluissa, jotka altistettiin NaN3:lle eri pitoisuuksina (0, 10, 20 ja 40 mM) 24 tunnin ajan, olivat 3,65, 6,99, 18,63 ja 39. Tällöin fluoresenssin intensiteetit olivat 3,65, 6,99, 18,63.35, mikä osoittaa, että NaN3-altistus lisäsi merkittävästi mitokondrioiden ROS-tuotantoa kontrolliryhmään verrattuna (P<0,05). Nämä tulokset viittasivat siihen, että NaN3:n aiheuttama apoptoosi paransi solunsisäisten ROS:ien tuotantoa.

NaN3 alentaa solun ATP:n titokondriaalista energiantuotantoa

NaN3:lle altistettujen PC12-solujen ATP-pitoisuuden arvioimiseksi suhteellinen luminesenssiyksikkö (RLU) määritettiin kvantitatiivisesti luminometrillä. Kuva 6 osoittaa, että NaN3inhibiitti mitokondrioiden ATP-tuotantoa ja vähensi asteittain solujen ATP-tasoa (P<0.05).

Pgc-1α:n ja apoptoosiin liittyvien proteiinien ilmentymistasot PC12-soluissa

Pgc-1α:n ilmentyminen proteiinitasolla väheni merkittävästi NaN3-altistumisen jälkeen kontrolliin verrattuna (P<0.05). Lisäksi Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2,Nrf-2 ja Cox IV ovat tunnettuja Pgc-1αdynamiikan myöhempiä kohteita eri solutyypeissä (8). Tässä tutkimuksessa todettiin, että NaN3-altistus esti merkittävästi Pgc-1α-dynamiikkaa annosriippuvaisella tavalla (P<0.01; Kuva 7A).

Lisäksi NaN3-altistus lisäsi Baxin ja sytokromi c:n ekspressiotasoja, kun taas se alensi Bcl-2:n ja prokaspasiini-3:n ekspressiotasoja (P<0.05). Bax/Bcl-2-suhde oli myös merkittävästi lisääntynyt kontrolliryhmään verrattuna (P<0.05; Kuva 7B).

Muut tärkeiden jäsenten, mukaan lukien CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK ja p-p38 MAPK, proteiinien ilmentymistasot arvioitiin myös. Tulokset osoittivat, että NaN3 lisäsi CaN:n ilmentymistä ja CaMKII:n ja p38 MAPK:n fosforylaatiota kontrolliryhmään verrattuna, kun taas CaMKII:n kokonaismäärän ja p38 MAPK:n ilmentymistasot eivät muuttuneet. Lisäksi p-CaMKII/CaMKII:n ja p-p38/p38 MAPK:n suhdeluvut NaN3-ryhmässä kasvoivat merkitsevästi verrattuna kontrolliryhmän suhdelukuihin (P<0.01; Kuva 7C).

Keskustelu

Mutta sen määrittämiseksi, estäikö NaN3 estänyt PC12-solujen lisääntymistä, verrattiin käsiteltyjen solujen lukumäärää logaritmisessa vaiheessa käsittelemättömien kontrolloidun solujen määrään. Solujen kasvu estyi ~75 % sen jälkeen, kun ne olivat olleet 24 tuntia alttiina 20 mM NaN3:lle. Siksi tätä pitoisuutta käytettiin myöhemmissä kokeissa. Apoptoosiin liittyy muutoksia solun morfologiassa, mukaan lukien kalvojen vuotaminen, solujen kutistuminen, kromatiinin tiivistyminen, ytimen pirstoutuminen ja DNA:n pirstoutuminen(9). Apoptoosin ydinmorfologian ja apoptoosinopeuden analysoimiseksi soluja altistettiin 0, 10, 20 ja 40 mM NaN3:lle 24 tunnin ajan.Käsittelyn jälkeen solut värjättiin DAPI:lla ja AnnexinV-FITC/PI:llä, ja tuman jakautuminen analysoitiin. Tulokset vahvistivat, että NaN3-altistus indusoi apoptoosia PC12-soluissa pitoisuusriippuvaisella tavalla.

Mitokondriot osallistuvat lukuisiin aineenvaihduntatoimintoihin, mukaan lukien solunsisäisen pH:n ylläpito ja ROS:n tuotanto, jotka edistävät ja säätelevät solujen apoptoosia (10). Solujen apoptoosin tunnusmerkkejä edeltävät mitokondrioiden muutokset, kuten ΔΨm:n häviäminen, energiantuotannon (ATP) väheneminen ja mitokondriokalvon läpäisevyyden lisääntyminen. Aiemmissa tutkimuksissa on esitetty, ettäROS aiheuttaa vaurioita mitokondrioiden hengitysketjussa ja aiheuttaa ΔΨm:n menetyksen, jotka ovat tekijöitä, jotka välittävät tai voimistavat hermosolujen toimintahäiriöitä hermoston rappeutumisen aikana ja johtavat siten hermoston rappeutumissairauksien kehittymiseen (11,12).NaN3:n tiedetään aiheuttavan rappeutumista ja eksitotoksisuutta lisäämällä mitokondriokalvon läpäisevyyspotentiaalia lipidiperoksidaation kautta (13-15), ja NaN3:n ensisijainen myrkyllinen vaikutus perustuu siihen, että se estää sytokromioksidaasin toiminnan mitokondrioiden sähkönsiirtoketjussa ja estää ATP:n tuotannon (4). Tässä tutkimuksessa FCM:ää käytettiin tunnistamaan ΔΨm ja ROS-tuotanto PC12-soluissa. Lisäksi tutkittiin ATP:n synteesiä mitokondrioissa eri NaN3-pitoisuuksille altistumisen jälkeen. Plasmakalvon rikkoutuminen, mitokondrioiden ROS-tuotannon lisääntyminen ja havaittu solujen ATP-pitoisuuden väheneminen viittasivat siihen, että NaN3-altistus indusoi apoptoosin PC12-soluissa.

Mitokondrioiden solukuolema voi aktivoitua useista ärsykkeistä, mukaan lukien kehitysohjelma, DNA-vauriot, endoplasmisen retikulumin stressi, kasvutekijä- ja ravintoaineiden puute, virusinfektio ja oksidatiivinen stressi (16). Koska Pgc-1α kuuluu jatkuvasti kasvavaan ydinsäätelijöiden perheeseen, se voi aktivoida suuren joukon geenejä ja säädellä energia-aineenvaihduntaan osallistuvien geenien ilmentymistasoja vasteena signalointireiteille, jotka välittävät termogeneesiä, glukoneogeneesiä, lihaksen kuitutyypin vaihtoa jamitokondrioiden biogeneesiä (17).Nämä yhteissäätäjät ovat olemassa ja toimivat suurissa moniproteiinikomplekseissa, joissa ne DNA:han sitoutumisen sijasta säätelevätNrf-1/2:tä ja Tfam:ia ja muokkaavat niiden transkriptionaalista tehoa edistämällä myöhempiä biokemiallisia vuorovaikutussuhteita, joita tarvitaan geenien transkription induktioon tai repressioon (8). Lisäksi Nrf-1/2 säätelee epäsuorasti mitokondrioiden DNA:n koodattujen geenien ilmentymistä indusoimalla voimakkaasti ydinkoodattuja Tfam A:ta, B1:tä ja B2:ta (Tfam, Tfb1m ja Tfb2m), jotka ovat mitokondrioiden genomin transkription ja replikaation säätelijöitä (18). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NaN3 on mitokondrioiden hengitysketjun kompleksi IV:n estäjä, joka vaikuttaa usein primäärisissä mitokondriohäiriöissä (19,20).Tässä tutkimuksessa PC12-soluissa tutkittiin ensin Pgc-1α-signaalikaskadin ilmentymistä, mukaan lukien Pgc-1α-perheen proteiinit (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 ja Tfam) ja Cox IV, jotta voitiin varmistua siitä, osallistuivatko nämä signalointitapahtumat NaN3:n aikaansaamaan apoptoosiin. Tulokset viittasivat siihen, että NaN3:n aiheuttama apoptoosi liittyi Pgc-1α-perheen proteiinien ja Cox IV:n ilmentymistasoihin mitokondriovälitteisessä signalointireitissä. Kun NaN3:n pitoisuuksia nostettiin, näiden proteiinien ilmentymistasot laskivat merkittävästi, mikä osoittaa, että ne voivat olla osallisina apoptoosin aktivoinnissa ja kehityksessä.

Käänteisesti, kompleksi IV voi laukaista apoptoosin primäärisissä aivokuoren neuroneissa, joka on kaspaasi3-riippuvainen ja liittyy sytokromi c:n vapautumiseen (5). Tiedetään hyvin, että mitokondriot ovat solujen apoptoosin keskeisiä säätelijöitä. Bcl-2-perheen proteiinit ovat mitokondriaalisen apoptoosireitin tärkeitä käynnistäjiä. Tähän perheeseen kuuluvat proapoptoottiset proteiinit Bax, Bcl-2:n homologinen antagonisti/tappaja ja Bcl-2-assosioitunut solukuoleman agonisti sekä antiapoptoottiset proteiinit Bcl-2 ja Bcl-extra large (Bcl-xL). Terveissä soluissa Bax on inaktiivinen sytosoliproteiini, mutta se siirtyy mitokondrioihin apoptoosin aikana. Se vaikuttaa pro-apoptoottisesti muodostamalla mitokondrioiden ulkokalvoon huokosen, jonka kautta sytokromi c vapautuu sytoplasmaan, mikä johtaa kaspaasi 3:n aktivoitumiseen (21). Anti-apoptoottiset proteiinit Bcl-2 ja Bcl-xL tukahduttavat Baxin toimintaa ylläpitämällä mitokondriokalvon eheyttä, mikä estää sytokromi-candin vapautumisen ja kaspaasi 3:n aktivoitumisen (22). Tässä tutkimuksessa NaN3 lisäsi pro-apoptoottisen Baxin ja sytokromi c:n tasoja ja vähensi anti-apoptoottisen Bcl-2:n ja prokaspasi-3:n tasoja, mikä osoittaa, että NaN3 käynnistimitokondriaalisen apoptoosisignaalin välittämisen PC12-soluissa.

Lisäksi Pgc-1α-ko-aktivaattoreiden ilmentymistasot ovat voimakkaasti indusoitavissa transkriptionaalisella tasolla monenlaisten ylempänä sijaitsevien signaalireittien kautta. Esimerkiksi liikunta ja kylmäaltistus indusoivat Pgc-1α:n ilmentymistä stressisignaalien ohjaamana solujen Ca2+- ja syklisen adenosiini-5′-monofosfaatti (cAMP)-signaalien kautta (23). Pgc-1α:n transkriptioon voivat vaikuttaa CaMK, kalsineuriini, β-adrenerginen reseptori/cAMP ja p38MAPK (24-26). Lisäksi MAPK-perheeseen kuuluvalla p38 MAPK:lla on keskeinen tehtävä solujen proliferaatiossa, erilaistumisessa, transformaatiossa ja apoptoosissa, sillä apoptoosin aktivoituminen voi indusoida Pgc-1α:n suoran fosforylaation kautta (27). Tässä tutkimuksessa tutkittiin Ca2+-signalointireittien (pan-kalkineuriini A ja p-CaMKII/CaMKII) ja p38 MAPK -reitin (p-p38MAPK/p38 MAPK ja p-Erk1/2) proteiinien ilmentymistasoja, jotta voitiin selvittää NaN3:n vaikutuksia solunsisäiseen Ca2+-homeostaasiin ja p38 MAPK:hon. Tiedot osoittivat, että pan-kalsineuriini A:n proteiinitasot ja p-CaMKII/CaMKII- ja p-p38MAPK/p38 MAPK-suhteet kasvoivat ja p-Erk1/2-taso laski NaN3-käsitellyssä ryhmässä, mikä viittaa siihen, että NaN3 laukaisi PC12-solujen apoptoosin annosriippuvaisella tavalla, ja tällainen aktivoituminen liittyi Ca2+:n ja p38 MAPK:n reitteihin. Kaiken kaikkiaan nämä kokeelliset tulokset vahvistivat, että NaN3 voi aiheuttaa PC12-solujen apoptoosia aktivoimalla Ca2+- ja p38 MAPK-reittejä. Tietojemme mukaan tämä tutkimus osoitti ensimmäistä kertaa, että NaN3 indusoimitokondrioiden välittämää apoptoosia PC12-soluissa Pgc-1α:aan liittyvien signaalireittien, kutenCa2+/p-CaMKII:n ja p38 MAPK:n, kautta.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus osoitti, ettäNaN3 voi indusoida PC12-solujen apoptoosia. NaN3-altistuksen taustalla olevan toksisen mekanismin selvittämiseksi tutkittiin useiden pro-apoptoottisten proteiinien (Bax ja sytokromi c) ja anti-apoptoottisten proteiinien (Bcl-2, prokaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII ja Pgc-1α) ilmentymistasoja. Tulokset vahvistivat, että pro-apoptoottisilla proteiineilla oli pro-apoptoottisia vaikutuksia PC12-soluihin CaMKII:n ja p38 MAPK:n aktivaation ja fosforylaation kautta, mikä stimuloi Pgc-1α:n ja prokaspase-3:n aktivaatiota PC12-soluissa. Tiedot tarjoavat perustan myöhemmille tutkimuksille, joissa tutkitaan NaN3:n vaikutusmekanismeja molekyylitasolla. Tuleviin tutkimuksiin voi sisältyä suojaavien aineiden, esimerkiksi mitokondrioiden jakautumisen estäjä 1:n, kinatsolinonin johdannaisen, joka on vastikään tunnistettu mitokondrioiden jakautumisen estäjä, lisääminen ennen NaN3-käsittelyä, jotta voidaan tutkia suojaavan aineen neuroprotektiivisia vaikutuksia NaN3:n aiheuttaman apoptoosin lieventämisessä PC12-soluissa ja lisäksi selvittää taustalla oleva mekanismi.

Kiitokset

Ei sovellu.

Rahoitus

Tämä tutkimus sai taloudellista tukea Kiinan kansallisen luonnontieteellisen säätiön (grantno. 81571848) ja Jiangsun korkeakoulujen ensisijaisten akateemisten ohjelmien kehittämisen apurahoista.

Aineistojen ja materiaalien saatavuus

Tässä tutkimuksessa käytetyt tai analysoidut tietokokonaisuudet ovat saatavissa vastaavalta kirjoittajalta kohtuullisella pyynnöllä.

Tekijöiden panos

YZ ja SZ ideoivat ja suunnittelivat tutkimuksen. YZ, JH,HX, TG ja YW hankkivat tiedot. YZ, JH ja HX analysoivat ja tulkitsivat tietoja ja laativat käsikirjoituksen. Kaikki kirjoittajat tarkistivat käsikirjoituksen kriittisesti ja lukivat ja hyväksyivät käsikirjoituksen lopullisen version.

Eettinen hyväksyntä ja suostumus osallistua

Ei sovellu.

Potilaan suostumus julkaisemiseen

Ei sovellu.

Kilpailevat etunäkökohdat

Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia etuja.

Sanasto

Lyhenteet

Lyhenteet:

.

NaN3	natriumatsidi
Cox IV	kompleksi. IV
Tfam	mitokondriaalinen transkriptiotekijäA
Nrf-1/2	ydinhengitystekijä-1/2
CaN	pan-calcineurin A
Pgc-1α	peroksisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α
PC12	rotan feokromosytooma
ΔΨm	mitokondrioiden kalvopotentiaali
CCCP	karbonyyli-syanidi3-kloorifenyylihydrazone
ROS	reaktiiviset happilajit
FCM	virtaussytometria
MAPK	mitogen-activated protein kinase

	Herbold M, Schmitt G, Aderjan R ja PedalI: Kuolemaan johtanut natriumatsidimyrkytys sairaalassa: A preventableaccident. Arch Kriminol. 196:143-148. 1995. PubMed/NCBI
	Marquet P, Clément S, Lotfi H, DreyfussMF, Debord J, Dumont D ja Lachâtre G: Analyyttiset löydökset itsemurhassa, jossa käytettiin natriumatsidia. J Anal Toxicol. 20:134-138. 1996.Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chang S and Lamm SH: Human health effectsof sodium azide exposure: A literature review and analysis. Int JToxicol. 22:175-186. 2003. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Leary SC, Hills BC, Lyons CN, Carison CG,Michaud D, Kraft CS, Ko K, Glerum DM ja Moyes CD: Krooninen käsittely atsidilla in situ johtaa sytokromi c -oksidaasiaktiivisuuden palautumattomaan häviämiseen holoentsyymin dissosioitumisen kautta. J BiolChem. 277:11321-11328. 2002. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Grammatopoulos TN, Morris K, Bachar C,Moore S, Andres R ja Weyhenmeyer JA: AngiotensinII attenuateschemical hypoxia-induced caspase-3 activation in primary corticalneuronal cultures. Brain Res Bull. 62:297-303. 2004. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Metabolic control ofmitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatorynetwork. Biochim Biophys Acta 1813. 1269-1278. 2011.
	Qian G, Guo JB ja Li L: The role ofPgc-1α and mitochondrial regulation in cardiovascular disease.Chinese Pharmacol Bull. 29:1-5. 2013.
	Jones AW, Yao Z, Vicencio JM,Karkucinska-Wieckowska A ja Szabadkai G: PGC-1-perheen koaktivaattoritja solun kohtalo: Roles in cancer, neurodegeneration, cardiovasculardiseasease and retrograde mitochondria-nucleus signaling.Mitochondrion. 12:86-99. 2012. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kerr JFR, Winterford CM ja Harmon BV: Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer.73:2013-2026. 1994. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chan DC: Mitokondriot: Dynamic organellesin disease, ageing and development. Cell. 125:1241-1252. 2006.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Islam MT: Oxidative stress andmitochondrial dysfunctionlinked neurodegenerative disorders. NeurolRes. 39:73-82. 2017. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chaturvedi RK ja Flint BM: Mitochondrialdiseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63:1-29. 2013.Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Laar VS, Roy N, Liu A, Raiprohat S,Arnold B, Dukes AA, Holbein CD ja Berman SB: Glutamaattieksitotoksisuus neuroneissa laukaisee Parkinin mitokondriaalisen ja endoplasmicreticulum-kertymisen ja N-asetyylikysteiinin läsnä ollessa mitofagian. Neurobiol Dis. 74:180-193. 2015. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu L, Peritore C, Ginsberg J, Shinh J,Arun S ja Donmez G: SIRT5:n suojaava rooli motorista alijäämää ja dopaminergistä rappeutumista vastaan MPTP:n aiheuttamassa hiirimallissaParkinsonin taudista. Behav Brain Res. 281:215-221. 2015. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Palomo GM ja Manfredi G: Exploring newpathways of neurodegeneration in ALS: The role of mitochondriaquality control. Brain Res 1607. 36-46. 2015. Näytä artikkeli : Google Scholar
	Youle RJ ja Strasser A: The BCL-2 proteininfamily: Vastakkaiset toiminnot, jotka välittävät solukuolemaa. Nat Rev MolCell Biol. 9:47-59. 2008. ViewArticle : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Vercauteren K, Pasko RA, Gleyzer N, MarinoVM ja Scarpulla RC: PGC-1-related coactivator: CREB/NRF-1-sidontadomeenin karakterisointi, joka liittyy sytokromi c:n promoottorin miehitykseen ja hengityskasvuun. Mol Cell Biol. 26:7409-7419. 2006. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Transcriptional paradigms inmammalian mitochondrial biogenesis and function. Physiol Rev.88:611-638. 2008. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Betts J, Lightowlers RN ja Turnbull DM: Neuropathological aspects of mitochondrial DNA disease. NeurochemRes. 29:505-511. 2004. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Tanji K, Kunimatsu T, Vu TH ja Bonilla E:Neuropathological features of mitochondrial disorders. Semin CellDev Biol. 12:429-439. 2001. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Aluvila S, Mandal T, Hustedt E, Fajer P,Choe JY ja Oh KJ: Organization of the mitochondrial apoptotic BAKpore: BAK-homodimeerien oligomerisaatio. J Biol Chem.289:2537-2551. 2014. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH,Thompson CB ja Korsmeyer SJ: Bad, heterodimeerinen yhteistyökumppaniBcl-XL:lle ja Bcl-2:lle, syrjäyttää Baxin ja edistää solukuolemaa. Cell.80:285-291. 1995. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hock MB ja Kralli A: Transcriptionalcontrol of mitochondrial biogenesis and function. Annu Rev Physiol.71:177-203. 2009. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Handschin C, Rhee J, Lin J, Tarr PT jaSpieglman BM: An autoregulatorinen silmukka kontrolloi peroksisomeproliferaattorilla aktivoidun reseptorin gamma-koaktivaattorin 1alfa ilmentymistä lihaksessa. Proc Natl Acad Sci USA. 100:7111-7116. 2003. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Schaeffer PJ, Wende AR, Magee CJ, NeilsonJR, Leone TC, Chen F ja Kelly DP: Kalsineuriini jakalsium/kalmoduliini-riippuvainen proteiinikinaasi aktivoivat erillisiämetabolisia geenien säätelyohjelmia sydänlihaksessa. J Biol Chem.279:593-603. 2004. Näytä artikkeli : Google Scholar
	Rohas LM, St-Pierre J, Uldry M, Jäger S,Handschin S ja Spiegelman BM: PGC-1 alfa:n säätelemä perustavanlaatuinen soluenergian homeostaasin järjestelmä. Proc Natl Acad SciUSA. 104:7933-7938. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Puigserver P, Rhee J, Lin J, Wu Z, YoonJC, Zhang CY, Krauss S, Mootha VK, Lowell BB ja Spiegelman BM: Energiankulutuksen sytokiinistimulaatio PPARgamma-koaktivaattorin-1:n PPARgamma-koaktorin-1:n p38:n kautta tapahtuvan p38:n MAP- kinaasiaktivaation kautta. Mol Cell. 8:971-982. 2001.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

.