Tutkimukset

Tutkimuksissamme olemme tarkastelleet yhtä EU:n viljelykasvia, Pisum sativum (herne). Herne on altis monille erilaisille viruksille, kuten herneen enation mosaiikkivirukselle, herneen varhaisen ruskettumisen virukselle ja useille perunaviruksen Y-ryhmään (Potyviridae) kuuluville viruksille. Viimeksi mainitussa ryhmässä papujen keltamosaikkivirus, papujen yleinen mosaiikkivirus, herneen mosaiikkivirus ja herneen siemenistä tarttuva mosaiikkivirus (PSbMV) ovat kaikki tärkeitä taudinaiheuttajia. Olemme tutkineet erityisesti PSbMV:tä, jolle kaikki kaupalliset herneenlajikkeet ovat alttiita. Alttiutta lisää se, että tämä virus tarttuu kasvista toiseen kirvojen välityksellä, mutta myös vertikaalisesti sukupolvesta toiseen siemenissä. Tämä ominaisuus on johtanut herneen itämiskokoelmien vakavaan saastumiseen ja tarjoaa erittäin tehokkaan keinon tartuttaa viljelykasvit varhain ja laajalle pian siementen itämisen jälkeen. Kun otetaan huomioon, että vain 0,1 prosentin siementen leviämistehokkuus johtaisi 10 000 tartuntaan sen jälkeen, kun siemeniä on kylvetty 107 kappaletta hehtaaria kohti, siementen leviämisen merkitys käy selväksi. Tällä hetkellä tätä ongelmaa torjutaan siemennäytteiden tehokkaalla sadonkorjuun jälkeisellä testauksella, jossa viruksen kuoriproteiini osoitetaan immunodetektorilla, ja saastuneiden siemenerien hylkäämisellä. Vaihtoehtoisesti ja koska siementen tarttuvuus vaihtelee useissa herneen lajikkeissa 0:sta 100 prosenttiin, olemme tutkineet, voisiko siementen tarttuvuuden vastustuskykyä kasvattaa parannetuissa herneen linjoissa. Testiristeytyksissä ja takaisinristeytyksissä sellaisten linjojen välillä, joilla ei ole lainkaan tai 60-80-prosenttista tarttuvuutta, resistenssi käyttäytyi dominoivana ominaisuutena, vaikkakaan F2- ja BC2-sukupolvissa se ei erottunut Mendelin ominaisuutena. Fenotyypin kvantitatiivinen luonne viittasi siihen, että siementen siirtymistä olisi vaikea sisällyttää resistenssiominaisuutena tavanomaiseen jalostusohjelmaan.

Pohjois-Afrikasta ja Aasiasta peräisin olevissa herneen lajikkeissa on havaittu luonnollista resistenssiä PSbMV:tä vastaan, mutta toistaiseksi näitä resessiivisiä geenejä ei ole siirretty kaupallisiin linjoihin. Geneettinen analyysi on osoittanut, että nämä geenit ovat klusteroituneet muiden resessiivisten geenien kanssa, joilla on erilainen potivirusspesifisyys, kahteen paikkaan herneen genomissa. Geenit sbm-1, sbm-3 ja sbm-4, jotka antavat vastustuskyvyn PSbMV:n patotyypeille PI, L-l ja P4, sijaitsevat kromosomissa 6, kun taas sbm-2, joka myös antaa vastustuskyvyn patotyypille L-l, sijaitsee kromosomissa 2 . Vaikka tämä järjestely viittaa paikalliseen geenien muuntumiseen ja translokaatioon kromosomien 2 ja 6 välillä, muut todisteet viittaavat siihen, että näillä kahdella geeniryhmällä voi olla erilainen alkuperä ja toiminta. Käyttämällä eri patotyyppien välillä tehtyjä rekombinanttihybridiviruksia viruksen avirulenssideterminantti on määritetty sbm-1:n viruksen genomiin liittyväksi proteiiniksi (VPg). Sbm-1-geenin rakenteellinen ja toiminnallinen analyysi on aiheena EY:n biotekniikkahankkeessa nro BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv), johon osallistuu tutkimusryhmiä ja teollisuutta Tanskasta, Suomesta, Espanjasta ja Yhdistyneestä kuningaskunnasta.

Sbm-1-geenin karakterisointi tarjoaa erityistä älyllistä ja käytännön hyötyä. Koska noin 20 prosenttia kaikista virusresistenssigeeneistä ja noin 40 prosenttia potyviruksille resistenssin antavista geeneistä on resessiivisiä, sen ymmärtäminen, miten sbm-1 toimii ja mikä kontrolloi vierekkäisten sbm- ja muiden potyvirusresistenssigeenien spesifisyyttä, on tärkeää monien tautien kannalta. Sbm- hankkeeseen liittyy kuitenkin myös teknisiä haasteita, eikä vähiten herneen genomin koon ja redundanssin huomioon ottaminen. Herneen genomi on noin 5 x 109 emäsparia haploidista genomia kohti eli noin 50 kertaa suurempi kuin Arabidopsis thalianan genomi. Herneen geenien karttapohjainen kloonaus ei ole onnistunut, eikä suuria inserttikirjastoja ole vielä saatavilla. Sbm-1:ssä on kuitenkin potentiaalia tunnistaa uusi resistenssigeenien luokka. Muista lajeista tähän mennessä kloonatut resistenssigeenit jakautuvat kahteen luokkaan. Vallitsevat resistenssigeenit, jotka toimivat tiettyjä viruksia, sieniä ja bakteereja vastaan, kuuluvat yleisesti ottaen ”NBS-LRR”-luokkaan, ja ne välittävät yliherkkää infektioresistenssiä. Ainoa kloonattu resessiivinen geeni (mlo) välittää ohran lajispesifistä vastustuskykyä härmäsientä vastaan, ja se liittyy myös patogeenin lokalisoitumiseen kuolleisiin soluihin. Toiminnallisesti Mlo toimii konstitutiivisen resistenssin negatiivisena säätelijänä. Sen sijaan sbm-1 on rotu- (tai patotyyppi-) spesifinen, eikä se liity solukuolemaan. Näiden vertailujen perusteella sbm-1:n useat toiminnalliset mekanismit vaikuttavat mahdollisilta. Ensinnäkin voimme pitää sbm-1:tä dominoivana alttiustekijänä, jota tarvitaan viruksen replikaation tukemiseen. Tämä sopisi yhteen VPg:n todennäköisen osallistumisen kanssa viruksen RNA:n replikaatioon ja sen havainnon kanssa, että vastustuskykyisten kasvien protoplasteissa ei ole havaittavissa viruksen replikaatiota. Toiseksi Sbm-1 voisi toimia Mlo:n tavoin resistenssin negatiivisena säätelijänä, vaikka spesifisyyserot mlo:sta asettaisivat sbm-1:n erilliseen resistenssigeenien luokkaan. Kolmanneksi sbm-1 voisi olla dominoiva mutta annosriippuvainen heikko resistenssialleeli. Suosimme ensimmäistä vaihtoehtoa suorimpana ja yksinkertaisimpana tulkintavaihtoehtona.

EY:n biotekniikkahankkeessa olemme päättäneet käyttää geneettisiä menetelmiä sbm-1-resistenssigeenin tuotteen tunnistamiseksi. Sopivien herneen linjojen tunnistamisen jälkeen (BC4-linjapari, joka kantaa homotsygoottisia resistenssi- ja alttiusalleeleja) on käytetty cDNA-AFLP-strategiaa introgressoidulta alueelta peräisin olevien ilmentyvien geenien tunnistamiseksi. Tähän mennessä on tunnistettu kymmenen polymorfista cDNA:ta. Niitä kartoitetaan parhaillaan käyttämällä rekombinanttisia sisäsiitosperheitä niiden genomisen alkuperän vahvistamiseksi. Vaihtoehtoinen strategiamme on ”kalastaa” sbm-1-geenin tuote käyttämällä hiiva-kaksoishybridijärjestelmää, jossa PSbMV VPg on syöttiproteiini. Kaksi vahvaa ehdokas-cDNA:ta ja kahdeksan muuta vuorovaikutusproteiineja koodaavaa cDNA:ta on tunnistettu herkästä herneen linjasta tehdystä herneen cDNA-kirjastosta. Nämä cDNA:t sekvensoidaan ja kartoitetaan parhaillaan.

Osana aiempaa EC-AIR-hanketta (# CT94-1171), johon osallistui akateemisia ja teollisia yhteistyökumppaneita Tanskasta, Ranskasta ja Yhdistyneestä kuningaskunnasta, olemme myös tutkineet mahdollisuuksia kehittää PDR:ää PSbMV:tä vastaan siirtogeenisissä herneissä. Koska muissa järjestelmissä viruksen replikaasigeeniä on yleisesti käytetty PDR:n aikaansaamiseksi käynnistämällä transkription jälkeinen geeninvaimennusprosessi (PTGS), käytimme PSbMV:n replikaasikistronia (NIb) siirtogeeniseen ekspressioon herneissä. Agrobacterium tumefaciensin T-DNA:lla, jossa on 35S-promoottori -Nib – 35S-terminaattorikonstruktio, ja bar-geenillä transformoidun kudoksen valikoivana merkkiaineena muuntuneen kudoksen valikoivana merkkiaineena Bialophos-herbisidin läsnä ollessa, muunnetuista 35 herneen linjasta kolme linjaa osoittautui resistentiksi PSbMV:tä vastaan. Kahdessa näistä linjoista oli suora toisto Nib-geenin 3′-päästä (NIbIb), koska oli jonkin verran näyttöä siitä, että monimutkaisilla siirtogeenijärjestelyillä oli enemmän mahdollisuuksia käynnistää PTGS. Kaikissa näissä linjoissa esiintyi eräänlaista PDR:ää, jota kutsutaan ”toipumiseksi”, jossa haasteellinen inokulaatio aiheuttaa alkutartunnan, mutta kasvit toipuvat nopeasti, eivätkä ne enää oireile tai kasva virusta. Toipuneet kudokset ovat tällöin vastustuskykyisiä homologisten tai läheisesti sukua olevien virusisolaattien aiheuttamille uusille haasteille. Tämän merkityksen arvioimiseksi pellolla, jossa kasvit voidaan haastaa sukulaisviruspopulaatiolla, arvioitiin PSbMV:n eri isolaattien kykyä laukaista PTGS ja joutua indusoidun PTGS:n kohteeksi. Tämä osoitti, että virukset, joiden NIb-kistroni on vähintään 89-prosenttisesti identtinen, voivat indusoida resistenssin, vaikka spesifisyysvaatimukset, joiden perusteella toinen haastajavirus voidaan katsoa kohteeksi, voivat olla korkeammat. Vertailun vuoksi mainittakoon, että kaksi eniten toisistaan poikkeavaa sekvensoitua PSbMV-isolaattia eroavat toisistaan 89 prosenttia Nib-alueella. Tämä ero spesifisyysvaatimuksissa PTGS:n laukaisemiseksi ja kohdentamiseksi on tärkeä näkökohta sovellettaessa teknologiaa kaupallisiin viljelykasveihin. Suhteellisen laaja resistenssi PSbMV-isolaatteja vastaan Nib-siirtogeenisissä herneissä eroaa luonnollisten sbm-resistenssigeenien äärimmäisestä patotyyppispesifisyydestä, jossa vain yksi tai muutama muutos viruksen avirulenssideterminantissa riittää muuttamaan PSbMV-isolaatin avirulentista virulentiksi.

Lyhyestä alkutartunta-ajasta huolimatta siirtogeeniset herneen kasvit osoittivat hyvää kasvua ja siementen kiinnittymistä haasteellisen inokulaation jälkeen ja antoivat kasvihuoneolosuhteissa vastaavan sadon kuin infektoitumattomat siirtogeeniset tai ei-siirtogeeniset linjat. Uskomme, että edellyttäen, että tehdään lisenssisopimukset, jotka kattavat bar-geenin käytön muunnettujen kasvien valinnassa, nämä kasvit voisivat olla hyödyllisiä lisäyksiä patogeeniresistenssigeenien paneeliin, jota käytetään uusien parannettujen herneen linjojen kehittämisessä.

Transgeeniset herneen kasvit edustavat ensimmäisiä palkokasveja, joilla on PDR-ominaisuuksia potyviruksia vastaan, ja ensimmäisiä kokeellisia esimerkkejä leguminosae-heimon kasveista, joilla on PTGS. Siksi oli arvokasta todeta, että PTGS:ää ja resistenssiä tässä järjestelmässä säätelevät periaatteet tukevat niitä periaatteita, joita on luonnehdittu yleisemmin käytetyillä koekasveilla (esim. Nicotiana spp.). Kuten PTGS:n osalta odotettiin, indusoitunut virusresistenssi liittyi siirtogeenin RNA:n ja PSbMV RNA:n hajoamiseen. Osoitimme myös, että PTGS:ää välitti näissä kasveissa systeeminen signaali, joka syntyi virusinfektion alkuvaiheessa, ja että tämä signaali saattoi välittää PTGS:n leviämistä indusoimalla metylaatiota NIb-siirtogeenin transkriptoituneella alueella .

Johtopäätöksenä totesimme, että maatalousteollisuus hyötyisi siitä, että herneillä olisi vakaa ja tehokas resistenssi PSbMV:tä vastaan. Vähiten kiistanalainen tapa saavuttaa tämä olisi sisällyttää luonnossa esiintyviä resistenssejä (joko siementen siirtymistä tai viruksen replikaatiota vastaan) tavanomaisia jalostusstrategioita käyttäen. Suhteellisen huono ymmärryksemme PSbMV:n siementen siirtymisen geneettisestä monimutkaisuudesta tarkoittaa, että tämä ei todennäköisesti ole hyödyllistä lyhyellä aikavälillä. Sbm-geenit ovat lupaavampia, vaikka läheisesti toisiinsa liittyvien geneettisten markkereiden puute ja resistenssin resessiivinen luonne aiheuttavat joitakin vaikeuksia. Vaihtoehtoisesti olemme osoittaneet, että resistenssiä voidaan luoda siirtogeenisen teknologian avulla, vaikka bioturvallisuuteen ja yleisön hyväksyttävyyteen liittyvät kysymykset on ratkaistava. Näiden soveltavien näkökohtien lisäksi tutkimus on tuottanut ja tuottaa parhaillaan aineistoa ja tietoa, joka vaikuttaa siihen, miten vastaavia lähestymistapoja voidaan käyttää muissa viljelykasveissa. Erityisesti uuden luokan virusresistenssigeenien vaikutusmekanismien ymmärtäminen on tärkeää.