Tulokset ja keskustelu
Pt:n hapettumisen kaksi reittiä E. coli:ssa. Geneettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että phn-operonin koodaama C-P-lyaasi pystyy hapettamaan Pt:tä (26). Tuoreessa tutkimuksessa (9) havaitsimme kuitenkin yllättäen, että jotkin E. coli phn-mutantit kykenivät edelleen hapettamaan Pt:tä. Näiden kantojen genotyypin tutkiminen viittasi siihen, että phoA-lokus saattaisi olla osallisena Pt:n hapettamisessa. Testataksemme tämän hypoteesin suoraan tutkimme E. coli -kantoja, jotka erosivat toisistaan ainoastaan phn- ja phoA-lokusten osalta, niiden kyvyn hapettaa Pt:tä, mikä osoitettiin niiden kyvyllä kasvaa väliaineessa, jossa Pt oli ainoa P-lähde. Koska kasvu edellyttää fosfaattia, organismit eivät voi kasvaa tällä väliaineella, ellei niillä ole kykyä hapettaa Pt:tä fosfaatiksi. Kannat, jotka olivat joko phoA + tai phn +, kasvoivat Pt-alustalla (riippumatta siitä, oliko toinen lokus mutatoitunut), kun taas kannat, joissa oli mutaatioita sekä phn:ssä että phoA:ssa, eivät kasvaneet (kuva 1). E. colilla on siis kaksi reittiä Pt:n hapettamiseen: toinen on phn-riippuvainen ja toinen phoA-riippuvainen.
Tämän hypoteesin tueksi havaitsimme Pt-riippuvaista H2-tuotantoa sekä in vitro että in vivo. In vitro -määritykset tehtiin aerobisesti suljetuissa pulloissa käyttäen erittäin puhdistettua BAP:tä. Inkuboinnin jälkeen headspace analysoitiin H2:n osalta ja vesipitoisesta osasta määritettiin fosfaatti. Kuten kuvasta 2B nähdään, Pt:stä tuotettiin stoikiometrisiä määriä fosfaattia ja H2:ta BAP:n läsnäollessa, kun taas kontrollireaktioissa, jotka sisälsivät joko BAP:tä tai pelkkää Pt:tä, ei tuotettu fosfaattia eikä H2:ta.
BAP-katalysoidun Pt:n hapettumisen tuotteet ovat fosfaatti ja molekulaarinen H2. (A) Protonista erotetut 31P-ydinmagneettiresonanssispektrit ja piikkien sijainnit on merkitty 5 mM Pt:n ja 5 mM fosfaatin kontrolleille sekä yön yli kestäneelle reaktiolle, joka sisälsi alun perin 5 mM Pt:tä ja 500 μg puhdistettua BAP:aa. Entsymaattisen reaktion spektrissä näkyy reagoimattoman Pt:n piikki ja uusi fosfaattipiikki, mutta muita tuotteita ei syntynyt. Pieni siirtymä fosfaattipiikin sijainnissa kontrollin ja BAP-katalysoidun reaktiotuotteen välillä johtuu pienistä pH-eroista: fosfaattivarastoliuoksen lisääminen määritykseen lisäsi pii-piikin korkeutta, mutta ei tuottanut uusia piikkejä. Protonikytkentäiset spektrit ovat täysin sopusoinnussa tämän tulkinnan kanssa (tietoja ei ole esitetty). (B) BAP-katalysoitu Pt-hapetus tuottaa stoikiometrisiä määriä fosfaattia ja molekulaarista H2:ta. In vitro -reaktioita, jotka sisälsivät ilmoitettuja komponentteja, inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa suljetuissa pulloissa. Tämän jälkeen otsatilan ilmakehästä määritettiin H2 kaasukromatografisesti lämmönjohtavuusilmaisimella, kun taas vesifaasista määritettiin fosfaatti malakiittivihreämäärityksellä. Reaktiot (3 ml) tehtiin 50 mM Mopsissa (pH 7,0), jossa oli 50 mM Pt (pH 7,0) ja 387 μg puhdistettua BAP:ta, kuten ilmoitettu. Kolminkertaiset kontrollit, jotka sisälsivät joko BAP:tä tai Pt:tä yksinään, suoritettiin, mutta näissä olosuhteissa ei havaittu fosfaattia eikä H2:ta. In vivo -tulokset osoittavat H2:n määrän, joka tuotettiin WM3924:n (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) kasvaessa 0,4-prosenttisessa glukoosi/Mops-liemessä, joka sisälsi 2,5 μmol ilmoitettua P-lähdettä. Koska tämä P-pitoisuus (500 μM) on kasvua rajoittava, P-lähteen odotetaan olevan täysin assimiloitunut, kun viljelmät saavuttavat saturaation. Kun kasvusto oli kasvanut yön yli 37 °C:ssa suljetuissa injektiopulloissa, lattiatilasta määritettiin H2 kaasukromatografialla, jossa oli lämmönjohtavuusilmaisin. Sekä in vitro- että in vivo-kokeet suoritettiin aerobisesti (eli O2 oli läsnä Pt:n hapettumisen aikana).
H2:n mittaamista in vivo vaikeuttaa se, että E. coli -bakteerilla on useita hydrogenaaseja, jotka voivat sekä tuottaa että kuluttaa H2:ta. Tämän ongelman kiertämiseksi rakensimme ΔhypABCDE-mutantin, joka ei pysty tuottamaan yhtään aktiivista hydrogenaasia, koska se ei kykene kypsyttämään prekursoriproteiineja (32). Hyp-mutantti, jota kasvatettiin aerobisesti suljetuissa putkissa, tuotti myös suunnilleen stoikiometrisiä määriä H2:ta viljelmissä, joita kasvatettiin kasvua rajoittavilla Pt-pitoisuuksilla, kun taas H2:ta ei havaittu viljelmissä, joita kasvatettiin rajoittavilla fosfaattipitoisuuksilla fosfaatilla tai fosfaattien fosfaattiesterin fosfoseriinilla (kuva 2B ).
Pt:n hapettuminen ei ole kaikkien emäksisten fosfataasien yhteinen ominaisuus. Tehokas Pt:n hapetus näyttää olevan E. coli -emäksisen fosfataasin ainutlaatuinen ominaisuus. Bacillus subtilis, jonka tiedetään tuottavan useita erittäin aktiivisia fosfataaseja (33), eikä P. stutzeri, jonka tiedetään tuottavan BAP:stä erilaista fosfataasia (kannoissa, joista puuttuu Pt-dehydrogenaasijärjestelmä) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson ja W. W. M., julkaisemattomat tiedot), eivät pysty käyttämään Pt:tä ainoana P:n lähteenä (kuva 3A ), vaikka kumpikaan organismi ei kasva väliaineissa, joissa ainoana P:n lähteenä oli fosfoseriini (tietoja ei ole esitetty). Näiden organismien tuottamat fosfataasit eivät siis kykene hapettamaan Pt:tä kasvun kannalta riittävällä nopeudella. Testasimme myös vasikan suoliston fosfataasin (CIP) ja katkaravun emäksisen fosfataasin (SAP) kaupallisia valmisteita niiden kyvyn tuottaa fosfaattia Pt:stä (kuva 3B ). Vaikka eukaryoottiset fosfataasit tuottivat pieniä määriä fosfaattia yön yli kestäneen inkuboinnin jälkeen, vain E. coli BAP kykeni katalysoimaan reaktiota merkittävällä nopeudella. Tämä havainto on erityisen yllättävä, koska eukaryoottiset entsyymit ovat itse asiassa paljon parempia fosfataaseja, joiden spesifinen aktiivisuus on jopa 40-kertainen BAP:hen verrattuna (27). Kaikilla näillä entsyymeillä on huomattavaa homologiaa (25-35 % identiteettiä) E. coli BAP:n kanssa; lisäksi useimmat aktiivisen alueen jäännökset, mukaan lukien Ser-102 (joka muodostaa kovalenttisen fosfo-entsyymivälituotteen fosfataasireaktion aikana), ovat konservoituja (27).
Pt:n hapettuminen on ainutlaatuista E. coli -emäksiselle fosfataasille. (A) Testattiin B. subtilis ja P. stutzeri -bakteerien kykyä hapettaa Pt:tä, mikä osoitettiin kasvamalla väliaineella, jossa Pt oli ainoa P-lähde, kuvassa 1 kuvatulla tavalla. Kumpikaan organismi ei kasvanut Pt-alustalla, kun taas molemmat organismit kasvoivat fosfaattialustalla. Huolimatta siitä, että molemmilla organismeilla on aktiivisia fosfataaseja, kumpikaan ei siis pysty hapettamaan Pt:tä riittävän nopeasti kasvun ylläpitämiseksi. P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) sisältää mutaatioita, jotka eliminoivat tämän organismin kaksi luonnehdittua Pt:n hapettumisreittiä mutta eivät vaikuta fosfataasin ilmentymiseen (9, 10). (B) BAP (E. coli alkalinen fosfataasi), SAP (katkaravun alkalinen fosfataasi; Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) ja CIP (vasikan suolistofosfataasi; Sigma) testattiin Pt:n hapettumisen osalta edellä kuvatulla tavalla. Käytimme kussakin määrityksessä 56 μg ilmoitettua fosfataasia, mikä vastaa 3 BAP-, 32 SAP- ja 65 CIP-fosfataasiyksikköä pNPP:n hydrolyysillä mitattuna. Vaikka eukaryoottisten entsyymien fosfataasiaktiivisuus oli paljon suurempi, vain BAP katalysoi Pt:n hapettumista merkittävällä nopeudella. Kahden kokeen keskiarvo on piirretty.
Vaikuttaa uskottavalta, että BAP katalysoi Pt:n hapettumista samanlaisella mekanismilla kuin fosfaattiesterin hydrolyysissä (kuva 4A ). Näin ollen BAP voi hydrolysoida Pt:tä hydridi-anionin toimiessa muodollisena poistuvana ryhmänä. Tätä ajatusta tukee se, että phoA-mutantti, jonka aktiivisen alueen Ser-102-jäännös on vaihdettu alaniiniksi, ei pysty käyttämään Pt:tä ainoana P-lähteenä, mikä osoittaa, että tätä aminohappoa tarvitaan fosfaattiesterin hydrolyysissä (27) ja Pt:n hapettumisessa (kuva 4B ). Vaikka suora hydridin siirto substraatista vesipitoiseen protoniin on biokemiallisesti ennennäkemätöntä, tämä reaktio on termodynaamisesti järkevä, kun otetaan huomioon fosfaatti-Pt-parin voimakas pelkistävä potentiaali (E o′ = -0,650 V). Näin ollen H:ta tuottava reaktio on varsin suotuisa: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (laskettu redox-potentiaalien perusteella viitteessä 34). Jos Pt:n hapettumisen hydrolyyttinen malli osoittautuu oikeaksi, kyseessä on hyvin epätavallinen entsymaattinen reaktio. Tutkimukset ovat osoittaneet, että BAP pystyy hydrolysoimaan myös fosfodiesterejä (35), fosfoamideja (36), sulfaattiestereitä (37) ja tiofosfaattia (38). Nämä reaktiot tapahtuvat kuitenkin huomattavasti hitaammin kuin Pt-hydrolyysireaktio, vaikka niihin liittyy paljon parempia poistuvia ryhmiä. Ne eivät myöskään ole redox-reaktioita. BAP ei katalysoi vastaavaa reaktiota, johon liittyy alkyylifosfonihappojen hydrolyysi, kuten on osoitettu sekä biokemiallisesti (39) että Δphn-kantojen kyvyttömyydellä käyttää näitä yhdisteitä ainoina P-lähteinä (13).
Pt:n hapettuminen BAP:lla voi tapahtua hydrolyysin avulla, jossa poistuvana ryhmänä on hydridi-anioni. (A) BAP:n suorittaman fosfaattiesterin hydrolyysin kemialliseen mekanismiin kuuluu aktivoidun seriinijäännöksen (Ser-102) nukleofiilinen hyökkäys fosfaattiesteriin, jolloin muodostuu fosfoseriini-entsyymivälituotetta. Alkoholioksidin poistuva ryhmä saa nopeasti protonin liuoksesta muodostaakseen vastaavan alkoholin. Vaikuttaa todennäköiseltä, että Pt:n hapettuminen tapahtuu samanlaisen mekanismin avulla, kun poistuva ryhmä on hydridi-anioni. (B) Ser-102:n roolia Pt:n hapettumisessa testattiin tutkimalla, voiko phoA-geenin Ser-102-Ala-mutaatiota kantava mutantti kasvaa Pt-mediassa, kuten kuvassa 1 on kuvattu. Mutantti ei pystynyt kasvamaan Pt-mediassa, mikä osoittaa, että aktiivisen paikan Ser-102 tarvitaan Pt:n hapetuksessa. Isäntäkanta oli BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 ja WM3611 kantavat yhden kopion integrantteja plasmideista pKY1 ja pKY2, jotka koodaavat villityyppistä phoA-geeniä (phoA+) tai phoA-S102A-mutanttia (Ser-102-Ala).
Pt-dehydrogenaasi (PtxD) oli ollut ainoa in vitro karakterisoitu entsyymi, jonka oli osoitettu katalysoivan Pt:n hapetusta (11). Vaikka BAP-reaktion yksityiskohdat ovat vielä selvittämättä, näiden kahden entsyymin kemialliset mekanismit ovat selvästi erilaiset. Siinä missä PtxD tarvitsee NAD:n elektroniakseptorina redox-reaktioon, BAP:n katalysoima reaktio ei vaadi eksogeenisia elektroniakseptoreita, vaan hyödyntää reaktion suurta termodynaamista liikkeellepanevaa voimaa vahvasti pelkistyneen tuotteen (H2) tuottamiseksi vedestä olennaisesti irreversiibelissä reaktiossa (laskettu K eq = 1,1 × 108). Kaikki muut tunnetut H2:tä tuottavat reaktiot toimivat paljon lähempänä kemiallista tasapainoa ja ovat yleensä palautuvia. Lisäksi kaikki muut tunnetut hydrogenaasit sisältävät joko Fe:tä tai Ni:tä tai molempia aktiivisissa keskuksissaan (40). Tähän havaintoon kuuluu myös metanogeenisten arkeoiden niin sanottu ”metalliton” H2:ta muodostava metyleenitetrahydrometanopteriinidehydrogenaasi, jonka tiedetään nyt sisältävän myös Fe:tä (41). Sen sijaan BAP ei sisällä redox-aktiivisia metalleja, vaikka hydrolyyttinen aktiivisuus edellyttää sekä Zn:ää että Mg:tä (27). BAP:n käsittely kelatoijilla estää Pt:n hapettumista, mikä viittaa siihen, että metalleilla on merkitystä Pt-reaktiossa (tietoja ei ole esitetty).
Loppujen lopuksi tässä esitetyt in vivo -tiedot viittaavat siihen, että Pt:n hapettumisreaktio on biologisesti merkityksellinen. Havainto siitä, että monilla bakteereilla on Pt:n hapettamiseen erikoistuneita entsyymejä, osoittaa, että tämä ominaisuus on voimakkaan valintapaineen alaisena mikrobipopulaatioissa (4, 5, 9, 42). Tätä silmällä pitäen on mielenkiintoista huomata, että vaikka eukaryoottiset entsyymit ovat paljon parempia fosfataaseja, ne eivät kykene Pt:n hapettamiseen. Tämä havainto herättää mahdollisuuden, että E. coli BAP ei ehkä ole kehittynyt tehokkaimmaksi fosfataasiksi vaan pikemminkin fosfataasiksi, jolla on kyky hydrolysoida Pt:tä. Tämä ajatus on sopusoinnussa sen kummallisen havainnon kanssa, että E. coli BAP ilmentyy erittäin voimakkaasti (jopa 6 % solun kokonaisproteiinista) fosfaattinälkiolosuhteissa (28). Perinteinen selitys tälle ilmiölle on, että jonkin tuntemattoman BAP:n substraatin on hydrolysoitava huonosti, ja siksi se vaatii valtavia määriä entsyymiä ylläpitääkseen kilpailukykyistä kasvunopeutta. Koska mitatuissa hydrolyysinopeuksissa on kuitenkin vain vähän eroja monien erilaisten fosfaattiesterisubstraattien osalta (39, 43), vaikuttaa epätodennäköiseltä, että tämä huono substraatti voisi olla fosfaattiesteri. Sitä vastoin Pt:n hydrolyysinopeus on huomattavasti alhaisempi kuin fosfaattiesterin hydrolyysinopeus, mikä viittaa siihen, että Pt saattaa olla substraatti, joka selittää fosfaattinälkäisessä E. coli -bakteerissa havaitun äärimmäisen phoA:n ilmentymistason.
On selvää, että monet yksityiskohdat BAP-reaktiosta Pt:n kanssa ovat vielä selvittämättä. Tämän ainutlaatuisen reaktion jatkotutkimus edistää todennäköisesti paitsi ymmärrystämme P:n redox-kemiasta ja fosforyylinsiirtoreaktioista myös tietämystämme hydridinsiirrosta, H2:ta tuottavista reaktioista ja pelkistyneiden P-yhdisteiden roolista luonnossa.