The Role of AGE/RAGE Signaling in Diabetes-Mediated Vascular Calcification

Abstract

AGE/RAGE signalは多くの異なる疾患状態、特に糖尿病においてよく研究されているカスケードであった．しかし，AGE/RAGEのシグナル伝達機構は，受容体や複数の経路が複雑に絡み合っているため，未だ十分に理解されていない。本総説の目的は、糖尿病の合併症としてAGE/RAGEが介在する血管石灰化の主要な部分に焦点を当てることである。 AGE/RAGEシグナルは、高血糖および石灰化状態において、PKC、p38 MAPK、フェツイン-A、TGF-β、NFκB、ERK1/2シグナル経路を通じて骨基質タンパク質を増加させる細胞および全身の反応に大きく影響する。 AGE/RAGEシグナルは、Nox-1の活性化とSOD-1の発現低下を介して、酸化ストレスを増加させ、糖尿病を介した血管石灰化を促進することが示されている。また、糖尿病を介した血管石灰化におけるAGE/RAGEシグナルは、AGEs誘導性石灰化において、VSMCsから骨芽細胞様細胞への表現型スイッチの結果として、酸化ストレスが増加することが原因とされた。研究者らは、薬理学的薬剤やある種の抗酸化物質が、AGEs誘発糖尿病による血管石灰化におけるカルシウム沈着のレベルを低下させることを見出した。 AGE/RAGEシグナルカスケードが糖尿病による血管石灰化に果たす役割を理解することで、この糖尿病合併症の重症度を下げるための薬理学的介入が可能になると考えられる

1. はじめに

糖尿病は、インスリンホルモンの産生および/または使用ができないために生じる血糖値の上昇または高血糖を特徴とする疾患群である。 I型糖尿病は膵臓β細胞の機能障害によりインスリンの分泌が低下し、II型糖尿病はインスリン受容体の機能障害により、インスリン受容体のシグナル伝達とグルコースの取り込みが連動しなくなることが原因です。米国では、人口の9.3％にあたる約2900万人が糖尿病を患っており、非常に高い頻度で発症しています。 18歳以上の糖尿病患者の心血管疾患による死亡率は、健常者の約1.7倍であると報告されています。糖尿病性心血管疾患による死亡率の増加は、この病態から生じうる合併症の重大性を示している。したがって、心血管疾患と糖尿病の関連性を理解することは不可欠です。

2. II型糖尿病と血管石灰化

II型糖尿病は、酸化ストレス、高血糖、高カリウム血症と、いくつかの異なるメカニズムによって血管石灰化に大きく関連しており、このレビューで主に焦点を当てている酸化ストレスはその一部である … 血管石灰化は、細胞外マトリックスへのハイドロキシアパタイト鉱物の沈着による血管内層の硬化と説明される。このプロセスは、かつては受動的で加齢に伴うものと考えられていたが、現在では厳密に制御された細胞を介するプロセスであることが証明されている … 血管石灰化の間、骨形成タンパク質-2 (BMP-2) は、骨中の骨芽細胞の成熟のための主要な転写調節因子として働くコア結合因子α-1 (CBFA-1, RunX2 とも呼ばれる) を活性化する . CBFA-1はまた、血管平滑筋細胞（VSMCs）内の骨芽細胞タンパク質の産生をアップレギュレートし、VSMCsの表現型が骨芽細胞様表現型に切り替わると考えられている。アルカリフォスファターゼ（ALP）とボーンシアロプロテイン（BSP）は骨芽細胞活性の初期マーカーであることが証明されているが、オステオポンチン（OPN）とオステオカルシンなどのマーカーは石灰化過程の後半にアップレギュレートされる . BSPの主な機能は、I型コラーゲンとその他の非コラーゲン性タンパク質からなるハイドロキシアパタイトの形成と沈着を促進することである。 ALPは、主に骨形成において、ピロリン酸をリン酸に分解し、骨内のハイドロキシアパタイトの沈着と鉱化を促進する役割を担っている。 BSPは、ヒドロキシアパタイト鉱物の核形成に関与している。 ALPと同様に、OPNもまたハイドロキシアパタイトの沈着に関連し、細胞接着とシグナリングのメディエーターとして機能することができる . ハイドロキシアパタイトのサイズと形状は、オステオカルシンがビタミンK依存性のメカニズムで媒介する。 Chenらによる一連の研究では、糖尿病患者と非糖尿病患者から採取した動脈を分析し、カルシウム、OPN、ALP、I型コラーゲン、BSPの量を決定した。 BSPを除くすべての骨基質タンパク質は、糖尿病の結果、有意に増加した。真性糖尿病（正常グルコース）および高血糖条件で培養したウシ血管平滑筋細胞（BVSMCs）を用いたin vitro実験では、高グルコース培地で培養した細胞でCBFA1、ALP、オステオカルシンのレベルが有意に高いことが明らかにされた。また、カルシウム沈着量も正常グルコース培地よりも高グルコース培地の方が有意に多く、この傾向は、両者の生育培地条件に石灰化培地を添加した場合にも観察された。石灰化培地は無機リン酸を高濃度に含有し、恒常性維持に必要な細胞の利用により石灰化を促進する。骨基質タンパク質発現の上昇に関与するシグナル伝達機構を明らかにするため、BVSMCsを高グルコースレベルに暴露し、正常細胞および高グルコース処理細胞の両方でプロテインキナーゼC（PKC）活性を薬理学的に阻害した。 PKCは、糖尿病や高血糖に対する細胞応答におけるその所定の役割から、シグナル伝達経路の焦点として選択された。その結果、骨基質タンパク質の発現が有意に低下した。一方、正常なグルコース処理細胞では、タンパク質発現に顕著な変化は見られなかった。この研究では、高グルコース培地で培養したBVSMCsからBMP-2の分泌が促進されることも証明された。全体として、Chen らは、糖尿病で観察されるような高血糖状態は、骨基質タンパク質のアップレギュレーションと血管石灰化を促進すると結論づけた。 Moriらの研究は、糖尿病ラットのVSMCsにおいて、OPNが同様のPKCを介した経路でアップレギュレートされ、活性化されることを示している。ウェスタンブロッティングにより、PKCの阻害がOPNタンパク質の発現を著しく低下させることが確認された。これらの研究により、血管平滑筋細胞における骨基質タンパク質の発現の優位性だけでなく、糖尿病を介した血管石灰化におけるPKCの役割も明らかになった。血管石灰化とAGE-RAGEシグナル

糖尿病や石灰化治療中のVSMCsにおける骨基質タンパク質発現の増加に加えて、先進糖化最終生成物（AGEs）とその受容体（RAGEs）も血管石灰化に関与する研究結果が示されている …

3．型糖尿病患者は、非糖尿病患者より有意に高濃度のAGEsを有することが示されている。 AGEsは、血中グルコースの増加に加え、ガラクトースやフルクトースなどの還元糖がタンパク質のアミノ基と反応してシッフ塩基を形成し、ポリオール経路を通ってAGEsを生成するか分解されることにより、一生の間に形成される。これらの糖化最終生成物は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質であるRAGEsと相互作用する。 RAGEは免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質で、循環血中AGEs濃度の上昇に対応して発現が増加する。 AGE-RAGEが結合すると、RAGEはPKC-ζを介して、p38 mitogen activated protein kinase（MAPK）、transforming growth factor-β（TGF-β）、nuclear factor κB（NFκB）を介して下流のシグナル伝達カスケードを活性化させる。 Sugaらは、ラットVSMCにおけるAGE-RAGEシグナルの活性化により、平滑筋ミオシン重鎖（SM-MHC）および平滑筋22α（SM22α）などのVSMC遺伝子マーカーの発現が低下することを明らかにした。このようなVSMCマーカーのダウンレギュレーションは、VSMCが骨芽細胞様表現型に切り替わる可能性を示唆している。このことは、RAGEの活性化が骨基質タンパク質であるALPのmRNA発現と活性を増加させ、血管石灰化におけるRAGEシグナルの役割を示唆するヒトVSMC（HVSMCs）の知見からも支持される。これらの研究は、PKC-ζシグナル、ALPの発現増加、VSMC遺伝子マーカーの発現減少を通じて、VSMC石灰化におけるRAGEの基本的な役割を示した。また、CBFA-1（RunX2）のmRNA発現、ALP活性、オステオカルシン蛋白質レベルも有意に上昇した。これらのデータから、AGE処理によりHVSMCの骨芽細胞様表現型が促進されることが示唆された。この表現型の変化は石灰化培地には依存せず、石灰化培地を用いて培養したHVSMCsと石灰化培地を用いないHVSMCsで同様の結果が得られた。骨芽細胞タンパク質のVSMCの発現は、p38 MAPK活性と関連している可能性がある。谷川らは、AGE曝露の増加に伴い、p38 MAPK活性が増加することを見出した。逆にRAGEシグナルが減衰するとp38 MAPK活性は低下し、AGEによる石灰化にもかかわらず、p38 MAPKの変化はALP活性の低下と相関していた … Huらによる同様の研究において、p38 MAPKはMC3T3-E1細胞の骨芽細胞分化に必須であることが示された。 p38 MAPKを薬理学的に阻害すると、ALP活性が低下することから、p38 MAPKが骨芽細胞様細胞のALP発現に必要であることが示された。したがって、ALP活性は、AGE暴露の増加とRAGEカスケードシグナルの上昇の両方がp38 MAPKを介して直接影響する可能性がある。このことから、p38 MAPKは糖尿病を介した血管石灰化におけるAGE-RAGE経路の重要な役割を担っていることが示唆された。また、糖化アルブミン（AGE-BSA）に24時間暴露すると、ALPとOPNのmRNAレベルが有意に上昇することも明らかになった。 AGE-BSA処理によるALPとOPNの増加から、当グループでは、ラットVSMCsにおいてRAGEの発現が増加していることも明らかにした。 RAGEに対する中和抗体とインキュベートすると、カルシウム量とALPの発現が減少した。このことから、RAGEがAGEによるVSMCの石灰化を媒介することが確認された。 Weiらは、糖尿病がWistar系雄性ラットの大動脈石灰化を促進することを示した。 von Kossa染色により、摘出した大動脈組織内のカルシウム粒子を可視化することができ、選択した組織切片内にカルシウム粒子が確認された。ウェスタンブロット分析により、糖尿病およびVDN処理動物でALPの発現が有意に増加し、AGEsのレベルも上昇した . AGE-RAGEシグナルは、糖尿病における血管石灰化を直接的に媒介する一方で、この糖尿病合併症に間接的に影響を与える可能性があることを指摘することは重要である

4. このような状況下において、フェツインAは血管石灰化およびRAGEシグナル伝達において重要な役割を担っている。患者のデータから、血清フェツイン-Aの高値はII型糖尿病の高血糖の指標であることが明らかになった。また、フェツイン-Aは、インスリン受容体のシグナル伝達経路に重要なインスリン受容体基質-1タンパク質の自己リン酸化を阻害することにより、インスリン受容体を阻害していた. これらの研究を総合すると、フェツイン-AはII型糖尿病におけるインスリン抵抗性に関与し、高血糖やその他の糖尿病合併症をさらに悪化させる可能性があることが明らかとなった。興味深いことに、血管石灰化レベルの上昇は、II型糖尿病だけでなく、慢性腎臓病（CKD）患者にも関連することが証明されている。血管石灰化は、炎症反応と酸化ストレス反応の両方を促進し、心血管系疾患の危険因子として複合的に作用することが示されています。フェツイン-Aは肝臓から放出され、自然免疫系の急性期タンパク質として機能し、過剰に発現した炎症性分子を抑制するために、抗炎症および抗酸化ストレス応答を促進する機能を有しています

逆に、フェツイン-Aは、一部Toll様受容体 (TLR) によって引き出される自然免疫応答を引き起こすこともできます。このメカニズムは、遊離脂肪酸（FFA）によって活性化され、炎症性反応を誘発することができる。 Pal らは、フェツイン-Aが TLR-4 のリガンドとして作用し、脂肪細胞における FFA 誘発性インスリン抵抗性を刺激することを示しました . また、フェツインAはRAGEの代替リガンドであるhigh mobility group box-1 (HMGB1)を阻害し、サイトカイン、接着分子、ケモカインの放出・動員を促進することが知られている。 RAGEシグナルカスケードの活性化は、HMGB1を介した腫瘍壊死因子（TNF）およびインターロイキン-1（IL-1）の発現に関与していることが明らかになっている。また、RAGEはAGEsを選択的に結合し、カスケードを活性化させる。フェツインA（Ahsg）は、骨や歯などの血管石灰化部位に存在するハイドロキシアパタイト結晶に高い親和性を有していることから、フェツインAはAGE/RAGE経路に間接的に影響を与えていると考えられる。 Kettelerらは、血液透析を受けているCKD患者を利用し、フェツイン-Aレベルの低下と血管石灰化の増加と心血管系死亡率の相関を示し、フェツイン-Aが石灰化の抑制剤として作用していることを示唆した。石灰化感受性を持つフェツインA欠損マウス（DBA/2-Ahsg-/-）を用いた研究では、この糖タンパク質が石灰化の阻害剤であることが決定された。骨のX線画像と肺、心臓、腎臓、皮膚のvon Kossa染色により、各組織型においてリンとカルシウムの沈着が視覚的に増加することがわかった。 DBA/2-Ahsg-/-動物から血清を抽出し、in vitroの塩基性リン酸カルシウム（BCP）沈殿アッセイを実施した。フェツイン-Aは血清中のBCP沈殿物の量を減少させ、フェツイン-AがBCP沈殿物の形成を抑制することが示された。同じ研究グループ内のHeissらは、電子顕微鏡と動的光散乱法を用いて、フェツイン-AがBCPと複合してカルシプロテイン粒子を形成する構造特性を明らかにした。精製したフェツイン-AとBCPを試験管内でインキュベートした追加の研究では、BCPの構造が硬質から脆弱な外観に変化した。このような構造変化は、CaCO3ナノ粒子などの他のカルシウム系材料でも観察された。

フェツイン-A、BCP、石灰化VSMCの関係は、in vitroおよびin vivo HVSMCモデル系を用いて決定された。 Reynoldsらは、フェツイン-Aが血管内層の石灰化したHVSMCsのマトリックス小胞に局在していることを示した。これらの石灰化したHVSMCsをフェツイン-Aで処理すると、カルシウム沈着とカルシウムの取り込みが用量依存的かつ細胞媒介的に抑制された。 VSMCsは、小胞およびアポトーシス体を介した血管石灰化を受けることが示されている。顕微鏡検査とウェスタンブロッティングにより、HVSMCのアポトーシスはフェツイン-Aにより抑制されることが明らかになった。放出されたマトリックスベシクルやアポトーシス体の石灰化をエネルギー分散型X線分析で定量化し、フェツイン-Aがこれらの放出された細胞粒子の石灰化も阻害することを示した。この同じ研究で、フェツイン-Aはマトリックスベシクルとアポトーシスボディを介したHVSMCの石灰化を抑制することが示された。 Moeらによる同様の研究において、フェツイン-AはBVSMCにおける石灰化の阻害剤であることが示された。これらのデータを総合すると、フェツイン-Aは石灰化の阻害剤であることが示された

5. 血管石灰化におけるAGE-RAGEシグナルと酸化ストレス

AGE/RAGEシグナルカスケードは、線維化の進展、RAGE発現の増加、酸化ストレスの増加といった結果をもたらすフィードフォワードループに似ていることが実証された。活性酸素の増加によって生じる酸化ストレスは、細胞膜、タンパク質、脂質、DNAなどの多くの細胞内構造を破壊する可能性がある。過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素などの活性酸素生成物は、ミトコンドリア酸化酵素、NADPH酸化酵素（Nox）、一酸化窒素合成酵素によって生成される。 RAGEの活性化は、TGF-β、NF-κB、Nox-1などの特定のシグナル伝達カスケードを刺激することにより、活性酸素の産生を増加させる。 Weiらによる研究では、糖尿病を介した血管石灰化動物モデルにおいて、マロンジアルデヒド（MDA）濃度とCu/Znスーパーオキシドディスムターゼ（SOD-1）活性を用いて、酸化ストレスと代償的酸化ストレス機構を開始する能力が評価された。 VDN誘発血管石灰化糖尿病動物では、糖尿病群に比べMDA量が有意に増加し、SOD活性値が有意に低下していた。単離したVSMCsをAGEで処理すると、ALP活性レベルの上昇、Nox-1を介した活性酸素の産生、RAGEの発現が見られた。 RAGEの発現を抑制すると、ALP活性、カルシウム量、Nox-1タンパク質の産生が減少し、同時にSOD-1レベルが上昇した。これらの研究により、VDNを介した血管石灰化モデル糖尿病の細胞は、糖尿病動物のみと比較して、ALP、ROS、Nox-1、RAGEタンパク質のレベルが有意に増加することから、AGE処理に応答することが示された。 Brodeurらは、同様の動物モデルを用いて、糖尿病が介在する血管石灰化が起こった後に、in vivoシステム内のAGEsを減少させることができるかどうかを検討した。 AGE阻害剤であるピリドキサミン（PYR）を石灰化予防薬として投与し、AGE分解剤であるアラゲブリウム（ALA）を石灰化後治療薬として投与した。これらの試験において、ALAのみ、大腿動脈のような筋肉質な動脈で測定されたAGEsの数とカルシウム含有量を有意に減少させることができたが、大動脈のような大きな伝導性の動脈では減少しなかった。 PYRは全体のAGEとカルシウム量を減少させたが、調査した組織では有意ではなかった。両治療法の効果の違いは、PYRがAGE予防として働くのに対し、ALAはAGE架橋破壊として働くという作用機序によるものであると思われる。また、α-lipioc acid、4-hydroxy tempol、Apocyninなど、いくつかの抗酸化物質の治療効果も検証された。アポシニン処理により、糖尿病を介した血管石灰化動物モデルにおいて、カルシウム沈着が有意に減少した。 Brodeurらは、標的活性酸素抗酸化療法によるカルシウムの減少が、in vivoの血管石灰化モデルにおいてより実現可能な治療法であることを実証した。これらの研究により、AGE/RAGEカスケードが酸化ストレス機構を介して血管石灰化を媒介することが明らかになり、活性酸素の産生を抑制する治療法が血管石灰化を抑制するためのより現実的な選択肢となる可能性が示された。は、RAGEの活性化によりリン酸化されることが判明した。さらに、TGF-βシグナルは、転写調節因子として働くメディエーターファミリーのSmadsのリン酸化を引き起こした。これらの変化は、TGF-ββ依存的であることがわかった。 RAGEの発現が低下すると、Smad 2のリン酸化も抑制され、AGE/RAGEカスケードがSmadの活性化およびTGF-βシグナル伝達に関与していることがウェスタンブロット解析により明らかとなった。 AGEsの蓄積は細胞外マトリックス（ECM）内であるため、TGF-βの増加が疾患内の線維化に関与していることに注目することが重要である。 Liらは、AGEsがI型コラーゲンの産生を増加させ、それがp38 MAPKとERK1/2シグナルの遮断によって抑制されることをウェスタンブロット分析で明らかにした。これらのデータから、AGE/RAGEシグナルは糖尿病におけるECMの維持・制御に関与しており、AGEsはRAGEの仲介によりTGF-βを誘導するという結論が導き出された。しかし、NFκBシグナルが増加すると、この表現型が妨げられ、心臓血管の糖尿病合併症によく見られる硬直と硬化が増加することが研究で明らかにされている。 Simardらは、ラット大動脈VSMCs（A7r5細胞）を糖化ヒト血清アルブミン（AGE-HSA）で処理し、GFP発現を用いてNFκB活性の有意な上昇を観察しました。ウェスタンブロット解析の結果、AGE-HSA処理によりERK1/2の活性化が有意に上昇し、AKTの活性化はわずかに上昇した。これらの経路はいずれもNFκBを活性化することから、RAGEシグナルがNFκB活性を上昇させるという結論が導き出された。 NFκBの転写活性が上昇すると、Pengらの報告にあるように、 AGEsで処理したマウスVSMCではI型コラーゲンa1およびa2のmRNA発現が上昇することがわかった。 AGEによるRAGEシグナルはVSMCsのNFκB活性に影響を与え、ECMのI型コラーゲンのリモデリングや細胞の形態変化を引き起こすことが示唆された。また、AGE-HSAで処理すると、平滑筋ミオシンヘビーチェア（SM-MHC）およびSM-22αのmRNAレベルが低下し、さらにSM-α-actin、SM-22α、ミオカルディン（MyoC）のタンパク質発現も低下することが分かった。これらの結果から、RAGEシグナルはA7r5細胞の平滑筋表現型マーカーの発現を阻害していることが明らかとなった。平滑筋表現型マーカーの消失は、AGE/RAGEシグナルが増加するにつれて平滑筋の力学的細胞特性が変化することの説明を提供するものであった。また、A7r5細胞内では粒状性が増加し、RAGEシグナリングの増加による細胞形態の変化が視覚的に確認された。 AGE-HAS処理細胞では、全体のアクチン密度は変化しなかったが、弾性の指標であるヤング率は、基底細胞の硬さが有意に増加し、硬く弾性の低い細胞タイプであることが示された。また、リン酸化ミオシン軽鎖（MLC）のタンパク質発現量を測定し、収縮機能とアクチン-ミオシンを介した運動活性の変化を調べたところ、アクチン-ミオシンを介した運動活性は、AGE-HAS処理細胞で低下し、アクチン-ミオシンを介した運動活性も低下した。これらの結果から、A7r5細胞をAGE-HSAで処理しても、収縮機能に変化は生じないことが明らかとなった。以上のことから、AGE/RAGEシグナルの増加は、VSMCsの力学的特性を変化させ、より硬く、より柔軟性の低い細胞タイプになることがわかった。結論

AGE/RAGEシグナルは複雑で入り組んだカスケードで、多くの異なる疾患状態で研究されてきた。特に、糖尿病を介した血管石灰化では、AGE/RAGEシグナルが細胞および全身の反応に大きく影響するいくつかの因子を示している。血管石灰化は、高血糖および石灰化状態において、PKCシグナルを介して骨基質タンパク質を増加させることが実証されている。 AGEsによる血管石灰化では、VSMCsマーカーのダウンレギュレーションと骨基質タンパク質のアップレギュレーションが起こり、したがって、VSMCsは骨芽細胞様細胞への表現型転換を受けることが示唆された。また、RAGEシグナルは多くの分裂促進経路を介してVSMCの石灰化を媒介することができる。その中でも、p38 MAPK経路はAGE/RAGEを介したVSMCの分化に必須な構成要素であることが示された。フェツインAもまた、血管石灰化においてより論議を呼ぶ役割を果たすことが示された。フェツインAは、RAGEリガンドとしてAGEsを人為的に選択することで石灰化を促進させるだけでなく、CDKの特定のモデルにおいて石灰化を抑制するメディエーターとして作用している。フェツインAは、糖尿病合併症である血管石灰化におけるその役割を理解するために、さらに研究が必要なエキサイティングな領域である。 AGE/RAGEシグナルは、Nox-1、TGF-β仲介線維症、NFκB、ERK1/2経路の活性化およびSOD-1の発現低下を通じて、糖尿病を介した血管石灰化に伴う酸化ストレスに関与していることが示唆されている。研究者らは、薬理学的薬剤とある種の抗酸化物質が、AGEs誘発糖尿病による血管石灰化におけるカルシウム沈着のレベルを減少させることを見出した。全体として、糖尿病を介した血管石灰化におけるAGE/RAGEシグナルの役割は、図1に示すように、酸化ストレスとAGEs誘発石灰化状態におけるVSMCsの表現型スイッチに起因するものであることがわかった。糖尿病合併症としての血管石灰化を理解するための今後の方向性として、RAGEノックアウトマウスを活用し、糖尿病を介した血管石灰化に対する全身的なRAGEの阻害の効果を検討することが考えられる。また、フェツインAの役割についても、このバイオマーカーとII型糖尿病におけるAGE/RAGEシグナルの相互作用を理解するために、より深く検討することができるだろう。

Disclosure

本資料で述べられている意見、発見、結論または推奨は、著者のものであり、必ずしも全米科学財団の見解を反映するものではありません。

Competing Interests

著者らは競合する利害関係がないことを宣言する。

Authors’ Contributions

すべての著者が本論文に等しく貢献している。

Acknowledgements

このレビューの作成と編集に貢献したDonna M. Gordon博士に著者らは謝辞を述べたいと思う。この研究は、American Heart Association Beginning Grant-In-Aid no.の支援を受けている。 4150122 (JAS), American Heart Association Scientist Development Grant no. 5310006 (JAS), and Mississippi State University and its Biological Sciences Department. また、本資料は、グラント番号2015202674の下、国立科学財団の大学院研究員プログラムの支援を受けた研究に基づいている

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